內(nèi)毒素致腎髓質(zhì)上皮細胞損傷與水通道蛋白2表達的關(guān)系.pdf

1、目的：腸屏障損傷導致內(nèi)毒素入血是梗阻性黃疸時腎功能損害的重要的病理生理機制之一。既往本課題組通過研究大鼠梗阻性黃疸動物實驗時發(fā)現(xiàn)，梗阻性黃疸時，腎集合管上皮細胞中AQP2的表達顯著降低。本實驗擬在細胞水平上明確內(nèi)毒素對大鼠腎髓質(zhì)上皮細胞的影響，以及水通道蛋白2表達的變化。 方法：培養(yǎng)并傳代大鼠腎髓質(zhì)上皮細胞系mIMCD—3，選取處于指數(shù)生長期的細胞制作細胞爬片，免疫組化DAB染色法檢測水通道蛋白2在大鼠腎髓質(zhì)上皮細胞mIMCD—

2、3的表達及定位。分別用終濃度為0.1，0.5，1，5，10μg/L的內(nèi)毒素與大鼠腎髓質(zhì)上皮細胞mIMCD—3培養(yǎng)12h，24h，48h，72h后用CCK—8檢測吸光度，計算細胞抑制率。選取作用明顯的終濃度為10μg/L的內(nèi)毒素作用于mlMCD—3后分別在4h，12h，24h，48h用流式細胞儀檢測凋亡。用同一濃度的內(nèi)毒素培養(yǎng)mIMCD—3在4h，24h后用免疫組化DAB染色法檢測水通道蛋白2的表達情況，并做光密度分析。所有計數(shù)資料均用均

3、數(shù)±標準差形式表示，運用統(tǒng)計軟件SPSS13.0進行單因素的方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果：①mIMCD—3表達AQP2。培養(yǎng)并制作細胞爬片后，用免疫組化和DAB染色可見，細胞胞漿中大量棕紅色顆粒，呈片或呈堆積狀排列，證明mIMCD—3表達AQP2，并且在基礎(chǔ)狀態(tài)下的AQP2主要定位于細胞漿中。同時行陰性對照的細胞做免疫組化時，沒有添加特異性結(jié)合的一抗，用DAB染色后胞漿中無棕紅色顆粒生成，整個胞漿為蘇木素淡染

4、的藍色，排除了AQP2表達的假陽性的存在。②LPS抑制腎髓質(zhì)上皮細胞mIMCD—3增殖。不同濃度分別做單因素方差分析，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。做組間兩兩分析時，12小時0.5μg/L和1μg/L，5μg/L和10μg/L；24小時0.5μg/L和1μg/L；72小時0.1μg/L和0.5μg/L，0.5μg/L和1μg/L，1μg/L和5μg/L，5μg/L和10μg/L比較，不具有統(tǒng)計學差異(P>0.05)。證明濃度低于5μg

5、/L時，LPS的濃度變化對細胞增殖的抑制作用差別不大，增大濃度梯度時，LPS對細胞的抑制作用明顯增強，具有濃度依賴性。濃度為0.1μg/L的LPS在對細胞作用的早期，對細胞不僅沒有抑制，反而有增殖的作用。當作用時間增加到72小時時，相鄰濃度組間的比較不具有統(tǒng)計學差異，各組間細胞的抑制率無差別。不同時間組分別行單因素方差比較，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。但0.1μg/L組12小時和24小時，0.5μg/L組12小時和24小時，24小時

6、和48小時比較，1μg/L組12小時和24小時比較，不具有統(tǒng)計學差異(P>0.05)。證明濃度低于1μg/L時，細胞的抑制率隨時間變化不大。濃度大于等于5μg/L時，任意兩兩組間對比均具有統(tǒng)計學差異。LPS對mIMCD—3的抑制作用具有時間依賴性。③LPS誘導腎髓質(zhì)上皮細胞mIMCD—3凋亡。將終濃度為10μg/L的LPS溶液作用于腎髓質(zhì)上皮細胞mIMCD—30h，4h，24h和48h后，經(jīng)流式細胞儀檢測，結(jié)果表明，LPS對mIMCD—

7、3的抑制作用主要表現(xiàn)為細胞凋亡，隨作用時間的延長，細胞凋亡增加(P<0.01)，同時作用時間和凋亡率具有直線相關(guān)性(R=0.9920)。④對腎髓質(zhì)上皮細胞mIMCD—3行組化染色可以看出，AQP2的表達主要位于細胞質(zhì)，表現(xiàn)為棕黃粗大的顆粒成片或成堆排列。LPS作用于mIMCD—3后，AQP的表達下調(diào)，細胞中棕黃色顆粒變稀疏，且顏色變淺。濃度為10μg/L的LPS作用細胞0小時，4小時和24小時的平均光密度分析，總體比較具有統(tǒng)計學差異(P

8、<0.05)。但組間作用時間4小時和0小時比較，不具有統(tǒng)計學差異(P=0.897)，24小時組和4小時組比較，24組和0小時組比較，明顯具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。證明在短時間內(nèi)，時間小于4小時，LPS對AQP2表達的變化沒有影響，但隨LPS作用時間的延長，AQP2的表達下降。 結(jié)論：mIMCD—3表達AQP2，基礎(chǔ)狀態(tài)下的AQP2主要定位于細胞漿中。LPS抑制mIMCD—3增殖，具有時間依賴性和劑量依賴性。LPS對細胞增殖