家蠶miR-2755-和miR-375-體外對BmFib-L和BmP25基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用.pdf

1、MicroRNA（miRNA）是一類長約19-22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA，在生物體內(nèi)發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。家蠶是一種重要的鱗翅目模式生物，家蠶絲腺具有高效、特異地合成絲蛋白的能力，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值。為了研究家蠶miRNAs對絲素蛋白基因表達(dá)的調(diào)控作用，國內(nèi)外很多科研機(jī)構(gòu)開展了家蠶 miRNA的研究，取得了許多重要進(jìn)展。本文在家蠶后部絲腺 miRNA高通量測序的基礎(chǔ)上，繼續(xù)篩選對絲素基因BmFib-L和BmP25基因表達(dá)具有調(diào)控

2、作用的miRNAs，并進(jìn)行實驗驗證。主要研究結(jié)果如下。
　　1. Bmo-miR-375*和bmo-miR-2755*在BmFib-L、BmP25 mRNA的3′UTR都有潛在的靶位點。
　　采用生物信息學(xué)方法篩選獲得對家蠶絲素輕鏈基因（BmFib-L）和 P25蛋白基因（BmP25）有潛在調(diào)控作用的miRNAs。應(yīng)用靶基因預(yù)測軟件預(yù)測與BmFib-L3′UTR和 BmP253′UTR作用的 miRNA分子，選擇靶基因預(yù)測有

3、靶位點且表達(dá)差異大的miRNAs，共獲得可能參與調(diào)控BmFib-L和BmP25基因的2個miRNAs（miR-375*、miR-2755*）。
　　2. Bmo-miR-375*和bmo-miR-2755*存在調(diào)控BmFib-L和BmP25基因表達(dá)的時空條件。
　　利用RT-PCR技術(shù)分析bmo-miR-2755*、bmo-miR-375*及其靶基因BmFib-L和BmP25在家蠶幼蟲4-5齡期后部絲腺和5齡3d不同組織中的

4、表達(dá)水平。提取家蠶幼蟲4-5齡后部絲腺和5齡3d不同組織的總RNA進(jìn)行bmo-miR-375*、bmo-miR-2755*、BmFib-L和BmP25的反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR。結(jié)果顯示四者在后部絲腺中的表達(dá)水平都較高,表明 bmo-miR-375*和 bmo-miR-2755*具有調(diào)控BmFib-L和BmP25表達(dá)的時空條件。
　　3. Bmo-miR-2755*在BmN細(xì)胞中顯著下調(diào)BmFib-L基因的表

5、達(dá)而上調(diào)BmP25基因的表達(dá)。
　　我們以 pcDNA3為載體，構(gòu)建 bmo-miR-2755*表達(dá)載體pcDNA3[ie1-egfp-pri-miR-2755*-SV40]；以 pGL3.0-Basic為載體，分別構(gòu)建 BmFib-L3′UTR、BmP253′UTR與報告基因 luc的融合報告質(zhì)粒 pGL3.0[A3-luc-Fib-L-3′UTR-SV40]和 pGL3.0[A3-luc-P25-3′UTR-SV40]。再以海

6、腎熒光素酶表達(dá)載體pRL-CMV為內(nèi)參，用bmo-miR-2755*表達(dá)載體和報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞，檢測報告基因luc的表達(dá)水平。結(jié)果表明bmo-miR-2755*顯著下調(diào)BmFib-L基因的表達(dá)；對BmP25基因的表達(dá)則有上調(diào)作用，但是調(diào)控作用未達(dá)顯著水平。
　　4. Bmo-miR-375*在BmN細(xì)胞中顯著抑制BmFib-L基因的表達(dá)而對BmP25基因表達(dá)無明顯的調(diào)控作用。
　　構(gòu)建真核 miRNA表達(dá)載體，以 p

7、cDNA3為載體，構(gòu)建 bmo-miR-375*表達(dá)載體pcDNA3[ie1-egfp-pri-miR-375*-SV40]；以 pGL3.0-Basic為載體，分別構(gòu)建 BmFib-L3′UTR、BmP253′UTR與報告基因 luc的融合報告質(zhì)粒 pGL3.0[A3-luc-Fib-L-3′UTR-SV40]和 pGL3.0[A3-luc-P25-3′UTR-SV40]。再以海腎熒光素酶表達(dá)載體pRL-CMV為內(nèi)參， Bmo-miR