雞腸炎沙門(mén)氏菌感染相關(guān)microRNA的鑒定及其與靶基因互作關(guān)系的研究.pdf

1、MicroRNA(miRNA)是一類長(zhǎng)度約22nt的內(nèi)源性非編碼小RNA，與靶基因3'UTR結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、神經(jīng)發(fā)育、脂肪代謝等很多生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。最近研究顯示，miRNA在細(xì)菌、病毒感染中也發(fā)揮重要作用。腸炎沙門(mén)氏菌是一種食源性病原菌，具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義，主要通過(guò)侵襲腸道粘膜，引起嚴(yán)重的腸道炎癥。宿主的遺傳背景在雞抵御腸炎沙門(mén)氏菌感染中起重要作用，不同品系（品種）的雞對(duì)腸炎沙門(mén)

2、氏菌的易感性/抗性有顯著差異。近幾年，Solexa高通量測(cè)序技術(shù)成為各物種microRNA分析鑒定的有力工具，目前關(guān)于細(xì)菌、病毒感染雞的方面都有應(yīng)用，microRNA在雞腸炎沙門(mén)氏菌感染中的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。
　　本研究利用腸炎沙門(mén)氏菌感染20周齡白來(lái)航雞，感染后第7天采集盲腸樣品，對(duì)照組與處理組分別構(gòu)建3個(gè)小RNA文庫(kù)，即對(duì)照組:Cp1、Cp2、Cp3，處理組:Tp1、Tp2、Tp3，共6個(gè)文庫(kù)。利用Solexa高通量測(cè)序技術(shù)分

3、析鑒定腸炎沙門(mén)氏菌感染后差異表達(dá)的miRNA，并利用熒光定量PCR對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析驗(yàn)證，同時(shí)，利用熒光定量PCR分析腸炎沙門(mén)氏菌感染后白來(lái)航雞與壽光雞盲腸組織中miRNA與其靶基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示:
　　(1)通過(guò)Solexa高通量測(cè)序，在Cp1、Cp2、Cp3、Tp1、Tp2、Tp3六個(gè)文庫(kù)中經(jīng)過(guò)篩選獲得clean data分別為1972566、3017995、2244711、10673073、1852677和270890

4、4，分別占到其總讀數(shù)的17.724％、33.542％、17.995％、58.832％、17.570％和30.987％。
　　(2)通過(guò)生物信息學(xué)分析，共鑒定了404個(gè)已知的雞miRNA以及194個(gè)新miRNA。處理組與對(duì)照組間共有37個(gè)顯著差異表達(dá)microRNAs，其中已知的miRNA19個(gè)，包括15個(gè)上調(diào)miRNA和4個(gè)下調(diào)miRNA;預(yù)測(cè)的新miRNA共18個(gè)，包括7個(gè)上調(diào)miRNA和11個(gè)下調(diào)miRNA。
　　(3)

5、采用miRanda軟件對(duì)差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，共預(yù)測(cè)到2897個(gè)不同的靶基因，其中636個(gè)靶基因僅由下調(diào)的miRNA調(diào)控(G1);841個(gè)靶基因僅由上調(diào)的miRNA調(diào)控(G2);1420個(gè)靶基因同時(shí)由下調(diào)和上調(diào)的miRNA調(diào)控(G3)。通過(guò)與Biomart數(shù)據(jù)庫(kù)中免疫相關(guān)的基因比對(duì)，共得到176個(gè)免疫相關(guān)的靶基因。
　　(4)利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶基因進(jìn)行功能分析，其中G1相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程注釋有118條，G2相關(guān)

6、生物學(xué)過(guò)程注釋有73條，G3相關(guān)生物學(xué)過(guò)程注釋有178條，各組中均有免疫相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程注釋顯著富集。顯著富集的信號(hào)通路主要有細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用、糖酵解/糖異生、焦點(diǎn)粘連、黑色素生成和蛋白酶體等。
　　(5)差異表達(dá)miRNAs的qRT-PCR驗(yàn)證，所選12個(gè)miRNA在白來(lái)航雞感染后第7天對(duì)照組與處理組盲腸組織中表達(dá)均差異顯著，其中11個(gè)miRNA的表達(dá)趨勢(shì)與測(cè)序結(jié)果一致，且差異倍數(shù)相近。在白來(lái)航雞感染后第14天盲腸中僅有

7、4個(gè)miRNA顯著差異表達(dá)，且調(diào)控方向均與測(cè)序結(jié)果相反;在壽光雞感染后第7天盲腸組織中，11個(gè)miRNA顯著下調(diào)。
　　(6) miRNA與免疫相關(guān)靶基因互作關(guān)系分析，在白來(lái)航雞感染后7天盲腸組織中，gga-miR-1416與TLR21、gga-miR-1416與BCL10、gga-miR-1662與TLR1LA、gga-miR-34a-5p與NOTCH和gga-miR-34a-5p與THBS1中miRNA與靶基因的調(diào)控方向相反;

8、在壽光雞感染后7天盲腸中，gga-miR-1416與IGJ、gga-miR-1416與TLR21、gga-miR-1662與TLR1LA和gga-miR-34a-5p與CCL4中miRNA與靶基因的調(diào)控方向相反。
　　本研究鑒定出37個(gè)與腸炎沙門(mén)氏菌感染相關(guān)的重要候選miRNAs;炎癥反應(yīng)、免疫系統(tǒng)發(fā)育、淋巴細(xì)胞活性、NF-kB級(jí)聯(lián)正調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程及焦點(diǎn)粘連、蛋白酶體信號(hào)通路相關(guān)miRNA在腸炎沙門(mén)氏菌感染中發(fā)揮重要的調(diào)控作用;