抗結(jié)核藥物新靶點的研究及排重系統(tǒng)的建立.pdf

1、結(jié)核病是一種死亡率較高的感染性疾病，嚴(yán)重威脅著全球的公共衛(wèi)生健康?，F(xiàn)有的抗結(jié)核一線藥物主要有利福平、異煙肼、乙胺丁醇、鏈霉素和吡嗪酰胺，它們的聯(lián)合應(yīng)用雖然對結(jié)核病的治療起到了重要的作用，但是耐藥及耐多藥結(jié)核病的涌現(xiàn)，使得發(fā)展新型抗耐藥結(jié)核藥物變得迫在眉睫。
　　 為了解決結(jié)核病的耐藥問題，本研究1）首先建立了機制排重系統(tǒng)，用于新型抗結(jié)核藥物的研發(fā);2）建立并應(yīng)用以ESX-1為靶點的高通量抗結(jié)核藥物篩選模型，驗證以此為藥靶發(fā)展新型

2、抗結(jié)核藥物的可行性;3）研究了結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞內(nèi)生存及致病性與宿主miRNA的關(guān)系，為研究結(jié)核分枝桿菌的致病機制及治療結(jié)核病的方案提供新思路。
　　 第一部分工作中，本研究依據(jù)異煙肼和利福平的作用靶點，通過將與異煙肼耐藥相關(guān)的inhA和與利福平耐藥的相關(guān)基因rpoB及其突變體在恥垢分枝桿菌中過量表達(dá)，構(gòu)建異煙肼和利福平耐藥株，并對其耐藥性進(jìn)行驗證。以此為基礎(chǔ)，我們建立了針對異煙肼和利福平類藥物的機制排重系統(tǒng)，用于新型抗結(jié)核藥物的

3、研發(fā)。
　　 第二部分工作中，本研究探索了以結(jié)核分枝桿菌體外生長非必需但與其致病性和細(xì)胞內(nèi)生存密切相關(guān)的ESX-1分泌系統(tǒng)為藥物靶點的可行性，以期得到既可以降低結(jié)核菌的毒力和細(xì)胞內(nèi)的生存力，又能夠減少產(chǎn)生耐藥性的可能性的新型抗結(jié)核藥物。首先通過以海分枝桿菌為模式菌，構(gòu)建將熒光素蛋白酶和具有信號肽序列的CFP-10蛋白融合表達(dá)的重組菌，用生物發(fā)光的方法測定上清中熒光素酶的活性，建立了以ESX-1分泌系統(tǒng)為靶點的篩選模型。將該分析方

4、法進(jìn)行一系列優(yōu)化后，得到了靈敏可靠、特異性高、重復(fù)性好的ESX-1抑制劑高通量篩選模型(Z'為0.92)。利用此模型我們對4000個化合物進(jìn)行篩選，得到具有抑制ESX-1分泌能力的三個陽性化合物。其中化合物IMB-BZ在體外沒有抑菌活性，但可以抑制細(xì)胞內(nèi)海分枝桿菌的生存(IC50=7.7μM)，而且其體內(nèi)抗菌活性與ESX-1密切相關(guān)。此外，我們還對IMB-BZ進(jìn)行了結(jié)構(gòu)改造與優(yōu)化。上述工作初步驗證了以ESX-1為靶點發(fā)展新型抗結(jié)核藥物的

5、可行性。
　　 第三部分內(nèi)容是研究宿主microRNA在結(jié)核分枝桿菌感染宿主細(xì)胞中的作用與功能。microRNA是一種內(nèi)源的小RNA分子，可以參與機體的許多生物功能的調(diào)節(jié)。利用人microRNA芯片技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)了在結(jié)核分枝桿菌感染的人巨噬細(xì)胞THP-1中17種microRNA的表達(dá)水平發(fā)生顯著性變化(P＜0.05)，表明宿主microRNA參與了病原（結(jié)核分枝桿菌）宿主的相互作用。同時，我們還發(fā)現(xiàn)了10種microRNA在致病