心肌梗死后NF-κB通路激活對交感神經(jīng)重構(gòu)的影響及美托洛爾的干預(yù)研究.pdf

1、隨著人們生活水平的不斷提高，飲食結(jié)構(gòu)及生活方式的轉(zhuǎn)變，心肌梗死（myocardial infarction，MI）的發(fā)病率日趨上升，現(xiàn)已成為發(fā)達(dá)國家乃至發(fā)展中國家所面臨的極其重要的公共衛(wèi)生問題。心肌梗死患者死亡率極高，根據(jù)流行病學(xué)資料顯示，在心肌梗死后存活患者中約50％的患者死于恢復(fù)期發(fā)生的惡性心律失常事件，因此，針對心肌梗死后室性心律失常（ventricular arrhythmias，VAs）的防治一直是臨床工作的重點及難點。

2、>　　隨著對心肌梗死后室性心律失常發(fā)生機制的深入研究，交感神經(jīng)重構(gòu)與心律失常的關(guān)系逐漸引起臨床及科研人員的關(guān)注。心肌梗死可引起心臟去神經(jīng)支配、神經(jīng)再生、交感神經(jīng)過度支配，即交感神經(jīng)重構(gòu)這一系列動態(tài)改變。這種心臟交感神經(jīng)的異常增生加重了心肌梗死后心肌的電生理異質(zhì)性及不穩(wěn)定性，進(jìn)而導(dǎo)致心肌梗死后室性心律失常易感性增加。因此，對心肌梗死后心臟交感神經(jīng)再生的調(diào)控應(yīng)該是預(yù)防或降低心肌梗死后致死性心律失常發(fā)生的有效手段，但目前對于心肌梗死后交感神經(jīng)

3、重構(gòu)的機制尚不明確，也在很大程度上制約了臨床上心肌梗死后抗心律失常治療的發(fā)展。
　　近年來一系列研究證實心臟局部或全身炎癥反應(yīng)均可上調(diào)心肌中神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致心臟交感神經(jīng)再生及重構(gòu)。核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)，作為重要的核轉(zhuǎn)錄因子，參與并介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，在炎癥級聯(lián)反應(yīng)中起到重要的“樞紐”作用。NF-κB激活被認(rèn)為是炎癥發(fā)生、發(fā)展中最重要的始動

4、環(huán)節(jié)，越來越多的證據(jù)表明NF-κB已成為炎癥相關(guān)性疾病治療的關(guān)鍵性靶點。心肌梗死可導(dǎo)致缺血心肌局部炎癥反應(yīng)，因此我們認(rèn)為，對于心肌梗死后交感神經(jīng)重構(gòu)，其預(yù)防或治療策略應(yīng)針對炎癥反應(yīng)軸或炎癥反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)中的上游調(diào)控因子，通過對初始環(huán)節(jié)的調(diào)控，改善心肌梗死后交感神經(jīng)過度再生及重構(gòu)。NF-κB正是炎癥反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)的上游調(diào)控因子，但目前尚無證據(jù)證實NF-κB激活與心肌梗死后交感神經(jīng)重構(gòu)的直接關(guān)系。多項大規(guī)模臨床研究表明，β受體阻滯劑可有效預(yù)防心肌梗死后

5、室性心律失常甚至心源性猝死的發(fā)生，此外，新近研究發(fā)現(xiàn)心肌梗死后長期應(yīng)用β受體阻滯劑美托洛爾可有效改善交感神經(jīng)重構(gòu)現(xiàn)象，并推測β受體阻滯劑的抗心律失常作用與其對交感神經(jīng)再生的抑制作用有關(guān)，但到目前為止，美托洛爾抑制交感神經(jīng)再生的機制仍不明確。
　　鑒于此，本課題擬在既往研究基礎(chǔ)上，通過建立心肌梗死動物模型，探討心肌梗死后NF-κB通路激活與心臟交感神經(jīng)再生的關(guān)系，并給予β受體阻滯劑美托洛爾干預(yù)，以期揭示美托洛爾抑制心肌梗死后心臟交感

6、神經(jīng)重構(gòu)的機制，為防治心肌梗死后心臟交感神經(jīng)重構(gòu)、降低室性心律失常甚至猝死的發(fā)生提供新的治療思路，并為臨床上心肌梗死后β受體阻滯劑的早期應(yīng)用提供理論依據(jù)。為了詳細(xì)闡明上述問題，本課題通過以下兩部分研究進(jìn)行探討:
　　第一部分、心肌梗死后NF-κB通路激活對心臟交感神經(jīng)再生的影響
　　目的:
　　明確心肌梗死后NF-κB通路激活是否參與心臟交感神經(jīng)再生過程，為心肌梗死后交感神經(jīng)重構(gòu)所致室性心律失常的防治提供新的靶點及思路

7、。
　　方法:
　　選取50只新西蘭兔作為研究對象并隨機分為3組:假手術(shù)組（Sham組）:開胸打開心包后冠狀動脈前降支穿線，不結(jié)扎;心肌梗死組（MI組）:開胸結(jié)扎冠狀動脈前降支制備心肌梗死模型;心肌梗死干預(yù)組（MI+PDTC組）:在心肌梗死模型基礎(chǔ)上給予NF-κB特異性抑制劑—吡咯烷二硫氨基甲酸鹽(pyrrolidinedithiocarbamate，PDTC;100 mg/kg/day)。1周后，所有成活動物行程序性電刺激

8、誘發(fā)室性心律失常，隨后處死動物，利用Masson染色評估心肌梗死范圍，并選取梗死灶周及左室游離壁組織進(jìn)行下列檢測:
　　1、采用免疫組織化學(xué)方法觀察生長相關(guān)蛋白43(growth associated protein43，GAP43)和酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)陽性神經(jīng)纖維分布并計算神經(jīng)纖維密度;
　　2、Western blot檢測心肌組織中神經(jīng)生長因子(nerve growth fac

9、tor，NGF)、NF-κB p65及IκBα蛋白表達(dá);
　　3、實時定量RT-PCR檢測心肌中NGF、白介素-1β(interleukin1β，IL-1β)及腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factorα，TNF-α)相應(yīng)mRNA表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、電生理實驗:Sham、MI、MI+PDTC各組心律失常易感性存在明顯差異，其室性心律失常誘發(fā)率分別為10％、53.8％及21.4％。
　　2

10、、神經(jīng)支配:1）GAP43陽性神經(jīng)纖維:Sham組少見或缺如，呈點狀分布;MI組較Sham組密度增加，且以梗死灶周為著;與MI組相比，MI+PDTC組神經(jīng)密度明顯降低。2）TH陽性神經(jīng)纖維:Sham組心肌纖維間可見其均勻分布，與心肌纖維走行方向—致;MI組神經(jīng)纖維密度明顯增加，空間分布紊亂，且部分粗大、密集，尤以梗死灶周明顯;與MI組相比，MI+PDTC組神經(jīng)密度明顯降低，且形態(tài)趨于正常。
　　3、NGF蛋白及mRNA表達(dá):與Sh

11、am相比，MI組NGF表達(dá)明顯上調(diào)，且以梗死灶周更為明顯;給予PDTC后，梗死灶周及左室游離壁NGF表達(dá)降低。
　　4、NF-κB通路激活水平:與Sham組相比，MI組NF-κB通路顯著激活，表現(xiàn)為心肌核蛋白中NF-κB p65含量增加，而胞質(zhì)蛋白中IκBα含量降低，且其下游轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物IL-1β及TNF-α mRNA明顯上調(diào);給予PDTC后，可明顯抑制NF-κB通路活化，減少NF-κB p65及增加IκB玖蛋白表達(dá)，并下調(diào)IL-1β

12、及TNF-α mRNA表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　1、心肌梗死后NF-κB通路激活可能是導(dǎo)致心臟交感神經(jīng)再生的機制之一;
　　2、PDTC可有效抑制心肌梗死后NF-κB激活，下調(diào)NGF表達(dá)，改善心肌梗死后交感神經(jīng)重構(gòu)并降低室性心律失常易感性。
　　第二部分、美托洛爾干預(yù)對心肌梗死后交感神經(jīng)重構(gòu)的作用及其機制
　　目的:
　　明確β受體阻滯劑美托洛爾改善心肌梗死兔心臟交感神經(jīng)重構(gòu)的作用是否與其抑制NF-κB

13、激活有關(guān)，進(jìn)一步深化β受體阻滯劑抗心律失常的機制。
　　方法:
　　選取50只新西蘭兔作為研究對象并隨機分為3組:假手術(shù)組（Sham組）:開胸打開心包后冠狀動脈前降支穿線，不結(jié)扎;心肌梗死組（MI組）:開胸結(jié)扎冠狀動脈前降支制備心肌梗死模型;心肌梗死干預(yù)組（Metoprolol組）:在心肌梗死模型基礎(chǔ)上給予酒石酸美托洛爾（5 mg/kg，溶于5 ml生理鹽水，每天2次）灌胃。1周后，所有成活動物利用PowerLab心室壓力-

14、容積系統(tǒng)監(jiān)測血流動力學(xué)指標(biāo)后，行程序性電刺激誘發(fā)室性心律失常，隨后處死動物，利用Masson染色評估心肌梗死范圍，并選取梗死灶周及左室游離壁組織進(jìn)行下列檢測:
　　1、采用免疫組織化學(xué)方法觀察GAP43和TH陽性神經(jīng)纖維分布、密度;
　　2、Western blot檢測心肌組織中NGF、NF-κB p65及IκBα蛋白表達(dá);
　　3、電泳遷移實驗（electrophoretic mobility shift assay

15、，EMSA）檢測NF-κB/DNA結(jié)合活性;
　　4、實時定量RT-PCR檢測心肌中NGF、IL-1β及TNF-α相應(yīng)mRNA表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、神經(jīng)支配:1）GAP43陽性神經(jīng)纖維:Sham組少見或缺如，呈點狀分布;MI組較Sham組密度增加，且以梗死灶周為著;與MI組相比，Metoprolol組神經(jīng)密度明顯降低。2）TH陽性神經(jīng)纖維:Sham組心肌纖維間可見其均勻分布，與心肌纖維走行方向一致;MI組神經(jīng)纖維

16、密度明顯增加，且空間分布紊亂，部分神經(jīng)纖維粗大、密集，尤以梗死灶周明顯;與MI組相比，Metoprolol組神經(jīng)密度明顯降低，形態(tài)及分布更趨于正常。
　　2、NGF蛋白及mRNA表達(dá):與Sham相比，MI組NGF表達(dá)明顯上調(diào)，且以梗死灶周為著;給予美托洛爾后，梗死灶周及左室游離壁NGF表達(dá)量顯著降低。
　　3、心肌組織中NF-κB p65及IκBα蛋白表達(dá):MI可導(dǎo)致NF-κB p65核移位，表現(xiàn)為心肌核蛋白中NF-κB p

17、65蛋白表達(dá)增加，胞質(zhì)中NF-κ B p65表達(dá)減少，且胞質(zhì)蛋白中IκBα蛋白表達(dá)降低;美托洛爾干預(yù)可顯著減少心肌核蛋白中NF-κB p65且增加胞質(zhì)蛋白中IκBα含量。
　　4、NF-κB/DNA結(jié)合活性:MI組NF-κB/DNA結(jié)合活性顯著增加，而美托洛爾干預(yù)可直接降低NF-κB/DNA結(jié)合活性。
　　5、炎癥因子IL-1β及TNF-α表達(dá):MI組IL-1β及TNF-α相應(yīng)mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào);美托洛爾干預(yù)后，NF-