水稻類受體胞質(zhì)激酶STRK1調(diào)節(jié)鹽脅迫的分子遺傳及生化分析.pdf

1、土壤鹽漬化是危害水稻（Oryza sativa L.）生長發(fā)育及產(chǎn)量的一個重要的環(huán)境因素。土壤中高濃度的鹽分會使離子失衡、水分虧缺、氧化傷害，并導(dǎo)致生物大分子被破壞、生長遲緩、甚至植株死亡。植物中的類受體蛋白激酶(Receptor-likekinases，RLKs)，是一類定位于細胞膜，由胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)激酶域組成，通過胞外結(jié)構(gòu)域感受外界環(huán)境脅迫信號，并通過胞內(nèi)激酶域催化靶蛋白的磷酸化，啟動相應(yīng)的生理生化等適應(yīng)性反應(yīng)來降低或

2、消除危害，因此RLKs在植物的逆境脅迫應(yīng)答過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。植物中類受體胞質(zhì)激酶(Receptor-like cytoplasmic kinases，RLCKs)是一類沒有胞外結(jié)構(gòu)域或跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白激酶，屬于RLKs超家族。目前的研究顯示水稻中許多RLCK的表達受非生物脅迫的調(diào)節(jié)，但只有極少數(shù)的RLCK被報道參與非生物脅迫反應(yīng)，并且其參與非生物脅迫反應(yīng)的分子機制也并不十分清楚。本研究中，通過芯片篩選受鹽誘導(dǎo)的部分水稻RLKs

3、基因，并用實時熒光定量PCR驗證，確定了6個受鹽誘導(dǎo)的RLKs基因，并構(gòu)建它們的過表達轉(zhuǎn)基因水稻植株。通過鹽脅迫處理篩選T2代過表達轉(zhuǎn)基因幼苗的表型，鑒定到了一個正調(diào)控水稻鹽脅迫的RLCK基因STRK1(salt tolerance receptor-like cytoplasmic kinase1)，并對其正調(diào)控水稻鹽脅迫的分子機理進行了研究。論文的具體研究結(jié)果如下:
　　(1)在幼苗期和生殖生長時期，過量表達STRK1增加了轉(zhuǎn)

4、基因植株對鹽脅迫的耐受性，而STRK1干擾植株則對鹽敏感。鹽脅迫條件下，與野生型相比，過量表達STRK1降低了轉(zhuǎn)基因幼苗的丙二醛(MDA)含量和相對電導(dǎo)率大小，表明在鹽脅迫條件下STRK1能降低膜的氧化損傷。同時，鹽脅迫處理下，STRK1轉(zhuǎn)基因植株的有效穗與野生型的相比沒有明顯變化，但是STRK1過表達植株的小穗育性和產(chǎn)量比野生型的高，而STRK1干擾植株的小穗育性和產(chǎn)量比野生型的低，說明鹽脅迫條件下STRK1的過表達改善了轉(zhuǎn)基因水稻的

5、產(chǎn)量。
　　(2) STRK1屬于RLCK，但是亞細胞定位顯示STRK1定位于細胞膜，當(dāng)把STRK1蛋白N端的3個半胱氨酸殘基突變?yōu)楸彼釙r(STRK1-C5，10，14A-YFP)，STRK1則定位于細胞質(zhì)，說明STRK1可能被棕櫚?；揎椂^定于細胞膜。與野生型相比，35S::STRK1-YFP的轉(zhuǎn)基因植株增強了對鹽脅迫的耐受性，而35S::STRK1-C5，10，14A-YFP的轉(zhuǎn)基因植株的抗鹽脅迫能力與野生型相比無明顯變化

6、，說明膜定位對STRK1傳遞鹽信號是必需的。STRK1的表達能被NaCl和H2O2處理所誘導(dǎo)。STRK1pro::GUS轉(zhuǎn)基因植株的GUS染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，STRK1主要在幼根，葉脈，莖、4天的幼苗、葉鞘和幼穗中表達。
　　(3)酵母雙雜交和BiFC實驗證明STRK1與水稻CATs家族蛋白（CatA、CatB和CatC）能相互作用。β-半乳糖苷酶活性分析顯示STRK1與CatC的相互作用強于與CatA和CatB的。Pull-down和

7、Co-IP實驗進一步驗證了STRK1與CatC的相互作用。在體外STRK1能磷酸化CatC，并激活CatC的酶活性，并且STRK1磷酸化CatC的加強依賴于STRK1被NaCl的激活。同時CatC的酶活性與與它的磷酸化程度呈正相關(guān)。
　　(4)為了研究STRK1對水稻過氧化氫酶(CAT)活性的影響，我們檢測了野生型和STRK1轉(zhuǎn)基因植株CAT的酶活性及H2O2的含量。鹽脅迫條件下，與野生型相比，STRK1的過表達能增加轉(zhuǎn)基因植株中

8、CAT酶活并降低H2O2的含量，而STRK1的干擾能降低轉(zhuǎn)基因植株中CAT酶活并增加H2O2的含量。這些結(jié)果說明STRK1通過調(diào)節(jié)CAT的酶活進而調(diào)控H2O2的平衡來增強對鹽脅迫的耐受性。
　　(5)為了研究STRK1對氧化脅迫的影響，我們用MV處理野生型和轉(zhuǎn)基因植株發(fā)現(xiàn)，在MV處理下，與野生型相比，STRK1的過表達能增強植株中CAT的酶活性，提高苗長和葉綠素含量，而干擾其表達則會使植株中CAT的酶活性減弱，苗長和葉綠素含量降低