DDR2重組腺病毒系統(tǒng)的建立及其與MMP-13活化相關(guān)性的初步研究.pdf

1、關(guān)節(jié)滑膜組織的過(guò)度增生和對(duì)軟骨的侵蝕是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA），關(guān)節(jié)軟骨破壞和關(guān)節(jié)畸形的直接原因。我們前期的研究表明，盤狀結(jié)構(gòu)域受體激酶（Discordin Domain Receptor 2, DDR2）在RA 成纖維樣滑膜細(xì)胞中高表達(dá)，并且此受體可以被膠原活化從而增加滑膜細(xì)胞MMPs 的表達(dá)水平，特別是MMP-13 被認(rèn)為是RA 關(guān)節(jié)軟骨破壞過(guò)程的限速酶，因此我們提出了如下假設(shè)：“II 型膠原－DDR2－MMP-13”這樣一個(gè)環(huán)路可能

2、是RA關(guān)節(jié)軟骨破壞的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。為深入探討DDR2－MMP-13 通路在RA 關(guān)節(jié)軟骨破壞中的作用，我們構(gòu)建了DDR2 腺病毒表達(dá)載體，并建立了穩(wěn)定檢測(cè)MMP-13 啟動(dòng)子活性的細(xì)胞模型，為驗(yàn)證我們提出的假設(shè)并深入研究此通路的關(guān)鍵信號(hào)分子奠定基礎(chǔ)。 1. DDR2 重組腺病毒的制備我們構(gòu)建的重組腺病毒系統(tǒng)包括：①攜帶野生型DDR2 cDNA 的重組腺病毒（Ad-DDR2flag）；②攜帶組成型活化DDR2 cDNA 的重組腺病毒（

3、Ad-FcDDR2）；③攜帶DDR2 特異性干涉序列的重組腺病毒（Ad-Si60）；④攜帶綠色熒光蛋白cDNA 作為對(duì)照的重組腺病毒（Ad-EGFP）。本研究使用AdEasy-1 腺病毒系統(tǒng)。首先構(gòu)建包含目的序列的穿梭質(zhì)粒（Shuttle plasmid），與腺病毒骨架載體AdEasy-1 在大腸桿菌BJ5183 中進(jìn)行重組，抽提各重組體質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染HEK293 細(xì)胞進(jìn)行包裝，待大部分細(xì)胞出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變（cytopathic effe

4、ct，CPE）時(shí)，低速離心收集細(xì)胞并重懸于PBS 中，-70℃/37℃反復(fù)凍融、振蕩，最后離心收集病毒上清于-70℃保存。采用TCD50 實(shí)驗(yàn)測(cè)定病毒滴度，應(yīng)用RT-PCR，Westernblotting 等技術(shù)對(duì)構(gòu)建的重組腺病毒鑒定，證明DDR2 相關(guān)腺病毒載體構(gòu)建成功。 2. 穩(wěn)定檢測(cè)MMP-13啟動(dòng)子活性細(xì)胞系的建立：①M(fèi)MP13啟動(dòng)子報(bào)告基因檢測(cè)載體的構(gòu)建：應(yīng)用PCR擴(kuò)增得到MMP13啟動(dòng)子序列及熒光報(bào)告基因Lucife

5、rase 序列，分別連入pcDNA4C 載體并置換出載體原有的CMV啟動(dòng)子。②MMP13 啟動(dòng)子報(bào)告基因載體的活性檢測(cè)：將構(gòu)建的載體與組成型活化DDR2 質(zhì)粒瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，無(wú)血清饑餓過(guò)夜DOX 誘導(dǎo)表達(dá)DDR2 24h 后，熒光素酶活性分析顯示，活化的DDR2 分子能使MMP-13啟動(dòng)子活性增加，證明新的MMP-13 啟動(dòng)子報(bào)告基因系統(tǒng)能夠被活化型DDR2 激活。③將構(gòu)建好的MMP13啟動(dòng)子報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)