DDR2在酒精性肝纖維化大鼠中的表達及DDR2基因RNA干擾慢病毒載體的構(gòu)建.pdf

1、背景和目的:盤狀結(jié)構(gòu)域受體（DDRs）是在研究表達于人類惡性腫瘤的酪氨酸激酶蛋白時發(fā)現(xiàn)的一種新的受體酪氨酸激酶（RTK）亞家族，其主要作用是感受微環(huán)境中膠原量和構(gòu)型的變化，然后以粘附、遷移、分化、生存、增殖的方式調(diào)節(jié)細胞反應。在哺乳動物中包括DDR1和DDR2兩類。研究顯示，DDR2在肝纖維化等病理過程中發(fā)揮重要作用。我們前期研究的動物實驗表明，在酒精性肝纖維化大鼠模型中，隨酒精灌胃進行與肝纖維化程度進展，DDR2表達呈時間依賴性增加，

2、且DDR2與肝組織內(nèi)Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原及血清透明質(zhì)酸、Ⅳ型膠原等均呈正相關，并且在經(jīng)治療肝纖維化減輕的大鼠中，出現(xiàn)DDR2表達下調(diào)，表明DDR2表達與和纖維化程度相關。本實驗進一步分析了盤狀結(jié)構(gòu)域受體2（DDR2）和基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）表達在大鼠酒精性肝纖維化發(fā)生中的作用。在以上研究的基礎上，設計并構(gòu)建大鼠DDR2基因的RNA干擾慢病毒載體，包裝病毒顆粒并篩選有效的RNA干擾病毒。為進一步研究DDR2的作用機制與肝纖維化等相關疾病

3、的臨床治療提供RNA干擾工具。 方法: 1、免疫組化檢測DDR2與MMP2在酒精性肝纖維化大鼠中的表達。 成年雄性Wistar大鼠共16只，正常飼養(yǎng)1周后隨機分為2組：正常對照組（N組）與模型組（M組）。其中模型組10只，在橄欖油拌平衡飼料喂養(yǎng)大鼠的基礎上，給予每日兩次白酒、吡唑混合液胃內(nèi)灌注，白酒折算成酒精后其量及濃度每兩周遞增一次，吡唑按25mg/kg·d溶于灌胃酒精中。正常對照組（6只）給予等量生理鹽水每日

4、兩次灌胃。模型組與正常對照組均于16周全部處死。取肝組織標本，通過HE染色、Masson染色觀察肝臟病理學改變，采用免疫組化染色方法觀察DDR2與MMP2在肝組織中的表達。 2、DDR2基因RNA干擾慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定。 （1）大鼠DDR2基因RNAi慢病毒載體的制備。 根據(jù)在Genebank中檢索的大鼠DDR2基因序列，設計3對針對大鼠DDR2基因的siRNA（small interference RNA，s

5、iRNA）序列 siRNA1、siRNA2、siRNA3，設計合成含有相應的短發(fā)夾RNA序列并具有AgeⅠ和EcoRⅠ酶切粘性末端干擾序列的雙鏈DNA oligo；pGCSIL-GFP慢病毒載體經(jīng)AgeⅠ和EcoRⅠ雙酶切后與雙鏈DNA連接重組，轉(zhuǎn)入用氯化鈣制備新鮮的大腸桿菌感受態(tài)細胞，進行陽性克隆篩選、PCR和測序鑒定，獲得相應vshRNA慢病毒重組載體DDR2/LV-shRNA。 （2）重組vshRNA慢病毒顆粒的包裝與滴度測

6、定。 將DDR2/LV-shRNA、pHelper1.0和pHelper2.0三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞，包裝擴增出相應的重組vshRNA慢病毒顆粒DDR2/Lenti-shRNA1、DDR2/Lenti-shRNA2、DDR2/Lenti-shRNA3，倍比稀釋法在293T細胞中測定病毒的滴度。 （3）有效DDR2 vshRNA慢病毒的篩選。 用DDR2 vshRNA慢病毒感染體外培養(yǎng)NRK52E細胞。72小時后在

7、熒光顯微鏡下觀察，根據(jù)細胞內(nèi)綠色熒光蛋白（GFP）的表達情況分析感染效率；5天后收集細胞實時熒光定量PCR法檢測DDR2 mRNA的表達水平。2-△△Ct法計算并比較各組病毒在細胞中對DDR2表達的基因沉默效應，篩選有效的DDR2 RNA干擾靶點。 結(jié)果： 1、酒精灌胃造模16周后，模型組大鼠肝組織病理檢查呈典型的輕度肝纖維化表現(xiàn)，肝組織內(nèi)膠原纖維較正常對照組顯著增多（P<0.01）。免疫組化檢測顯示，模型組DDR2、M

8、MP2表達較正常對照組均有顯著性增加（P<0.01），且DDR2在肝組織內(nèi)的分布與膠原纖維分布相一致。 2、對重組陽性克隆的PCR鑒定顯示，連接入vshRNA片段的陽性克隆PCR片段大小為343bp（從載體中切掉24bp），沒有連接入vshRNA片段的空載體克隆PCR片段大小為306bp，鑒定結(jié)果和預期一致。測序結(jié)果表明合成的各組DDR2 vshRNA核苷酸序列均插入正確。采用慢病毒載體系統(tǒng)在293T細胞中包裝獲得3組重組慢病毒

9、，病毒滴度達到2×108TU/mL。分別感染NRK52E細胞后，熒光顯微鏡下觀察各重組慢病毒的感染效率均達到80％。RT-PCR檢測分析顯示，DDR2/Lenti-shRNA1和DDR2/Lenti-shRNA3對NRK52E細胞DDR2 mRNA表達的抑制效率達到80％以上。 結(jié)論： 1、通過給予橄欖油拌平衡飼料喂養(yǎng)及白酒、吡唑混合液灌胃可以成功建立酒精性肝纖維化大鼠模型。DDR2可能通過MMP2介導膠原與肝星狀細胞間