2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、本文主要從以下幾個方面展開論述:
  第一部分 了解Purα缺失片段對APP啟動子下調(diào)的作用效果來確定Purα蛋白的活性功能域以及其與Egr-1之間的相互作用
  目的:淀粉樣前體蛋白(APP)是一種跨膜蛋白,它的異常代謝產(chǎn)物A-β在神經(jīng)組織中的積累所形成的senile plaque是Alzheimer病的主要發(fā)病因素之一。前期的實(shí)驗結(jié)果已經(jīng)證實(shí),Purα蛋白能下調(diào)APP基因的表達(dá),而Egr-1蛋白則能上調(diào)APP基因的表達(dá)。

2、然而Purα蛋白的五個功能區(qū)域在此調(diào)節(jié)過程中是如何發(fā)揮作用的,它的活性功能域究竟位于什么地方,目前仍然不是十分清楚。通過研究了解Purα缺失片段對APP啟動子下調(diào)的作用效果來確定Purα蛋白的活性功能域以及其與Egr-1之間的相互作用,正是我們所研究的主旨所在。
  方法:(1)根據(jù)Purα和Egr-1基因序列設(shè)計引物,構(gòu)建pCDNA3-Purα缺失突變體、pCDNA3-Egr-1質(zhì)粒、pGEX4T1-Purα缺失突變體和pGEX

3、4T1-Egr-1質(zhì)粒。(2)Luciferase assay,將Purα缺失突變體和APP啟動子共轉(zhuǎn)染到U87細(xì)胞,通過對APP活性的分析,確定Purα對APP調(diào)控作用的功能區(qū)域。(3)Pull-down assay和Co-IP,確定Purα蛋白和Egr-1蛋白之間是有否直接的相互作用(physical interaction)。
  結(jié)果:(1)重組質(zhì)粒pCDNA3-Purα缺失突變體和pCDNA3-Egr-1質(zhì)粒以及pGEX

4、4 T1-Purα缺失突變體和pGEX4 T1-Egr-1質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定和測序后,證實(shí)克隆序列完全正確。(2)Luciferase assay證實(shí)Purα全長對APP基因表達(dá)下調(diào)作用最大,其他四個突變體對APP基因表達(dá)下調(diào)作用各不相同。(3)通過Pull-down assay和Co-IP實(shí)驗,沒有發(fā)現(xiàn)Purα蛋白和Egr-1蛋白之間有直接的相互作用(Physical interaction)。
  結(jié)論:(1)Purα蛋白對AP

5、P基因表達(dá)的調(diào)控依賴于其結(jié)構(gòu)的完整性,Purα結(jié)構(gòu)越完整,對APP啟動子下調(diào)作用的效果越明顯,說明五個不同的蛋白結(jié)構(gòu)域共同作用才能發(fā)揮對APP基因的最大的調(diào)控作用。(2)Purα蛋白和Egr-1蛋白沒有直接的相互作用(Physical interaction),由于兩種蛋白在APP基因啟動子上的結(jié)合部位是重合的,兩者有可能通過競爭性結(jié)合其在APP啟動子的5’ UTR區(qū)中的結(jié)合位點(diǎn)而發(fā)揮調(diào)控作用,這也肯定了我們以前所提出的兩種蛋白之間存在

6、有一種互相置換作用的假說(Displacement hypothesis)。
  第二部分 構(gòu)建Purα基因過表達(dá)以及SiRNA慢病毒表達(dá)載體,通過包裝病毒,以用于神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞感染及原代培養(yǎng)的神經(jīng)元的基因操作
  目的:構(gòu)建Purα基因過表達(dá)以及SiRNA慢病毒表達(dá)載體,通過包裝病毒,以用于神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞感染及原代培養(yǎng)的神經(jīng)元的基因操作。
  方法:1.過表達(dá)載體的構(gòu)建,本實(shí)驗使用pCDH-EF1-MCS-T2A-cop

7、GFP和pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP慢病毒載體,首先根據(jù)pCDH載體所含的多克隆位點(diǎn)的特點(diǎn)來選擇所要插入的內(nèi)切酶位點(diǎn),合成含有該酶切位點(diǎn)的用于擴(kuò)增 Purα基因的上,下游引物,擴(kuò)增Purα全長基因,將PCR片段進(jìn)行純化和酶切,然后亞克隆到pCDH載體相應(yīng)的多克隆位點(diǎn)之中,進(jìn)行酶切和測序鑒定;2.ShRNA慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建:利用計算機(jī)輔助,選取有可能作為PurαSiRNA的序列,根據(jù)shRNA的特征,設(shè)計shRNA的

8、DNA序列以及其反向互補(bǔ)序列,然后合成該寡核苷酸,將該寡核苷酸退火,形成雙鏈DNA片段,然后再克隆到慢病毒載體pLKO.1 Puro的相應(yīng)位點(diǎn)中,通過測序鑒定陽性克隆。3.慢病毒包裝和滴度測定:將克隆好的pCDH-Purα和pLKO.1 puro-shRNA載體和病毒包裝質(zhì)粒pCMV-VSV-G,pCMV-dR8.2 dvpr按相應(yīng)的比例轉(zhuǎn)染到293FT細(xì)胞中,48小時后收集上清液,純化,濃縮,進(jìn)行滴度測定。
  結(jié)果:測序結(jié)果證

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