依普利酮對鳥苷酸環(huán)化酶偶聯(lián)受體-A基因敲除小鼠心室重構(gòu)作用的研究.pdf

1、近年來心力衰竭發(fā)病率和死亡率持續(xù)增長，正在成為21世紀最重要的心血管病癥。目前已明確，導(dǎo)致心力衰竭發(fā)生發(fā)展的基本機制是心肌重構(gòu)。心肌重構(gòu)是由于一系列復(fù)雜的分子和細胞機制造成心肌結(jié)構(gòu)、功能和表型的變化。在初始的心肌損傷以后，腎素一血管緊張素一醛固酮系統(tǒng)(RAAS)和交感神經(jīng)系統(tǒng)興奮性增高，多種內(nèi)源性的神經(jīng)內(nèi)分泌和細胞因子激活；其長期、慢性激活促進心肌重構(gòu)，加重心肌損傷和心功能惡化，周而復(fù)始，形成惡性循環(huán)。因此，治療心力衰竭的關(guān)鍵就是阻斷神

2、經(jīng)內(nèi)分泌的過度激活，阻斷心肌重構(gòu)。 大量研究表明，長期用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)或血管緊張素Ⅱ受體1阻滯劑阻斷RAAS期間，醛固酮水平不能保持穩(wěn)定持續(xù)的降低，此現(xiàn)象可削弱甚至逆轉(zhuǎn)這類藥物的心臟保護作用。另外，充血性心力衰竭患者應(yīng)用醛固酮受體拮抗劑可降低心血管相關(guān)發(fā)病率和死亡率，如RALES和EPHESUS臨床研究均證實醛固酮受體拮抗劑的應(yīng)用可降低進展性心力衰竭患者的總死亡率。這些發(fā)現(xiàn)使人們越來越認識到醛固酮在心血管病中

3、的重要病理生理作用。 目前已明確醛固酮可作用于非上皮細胞的鹽皮質(zhì)激素受體(豫)。對噬齒類動物模型的體內(nèi)外研究證明了醛固酮在高血壓、心肌壞死及纖維化發(fā)展中的作用。醛固酮作為致纖維化和致炎性激素，以及在心室重構(gòu)中的作用成為目前研究熱點。 利鈉肽由三種肽組成：心鈉肽(ANP)、腦或B-型尿鈉肽(BNP)和C-型利鈉肽(CNP)。ANP和BNP主要在心臟合成：ANP在心房BNP在心室。CNP主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達。利鈉肽有三個受

4、體被克隆。利鈉肽受體-A(NPR-A)和利鈉肽受體-B(NPR-B)是通過鳥苷酸環(huán)化酶介導(dǎo)，它們利用環(huán)鳥苷酸(cGMP)作為細胞內(nèi)信使，因此，NPR-A又稱為鳥苷酸環(huán)化酶偶聯(lián)受體-A(GC-A)。ANP和BNP更易與GC-A結(jié)合，而CNP更易結(jié)合于NPR-B。從心臟釋放的ANP和BNP可即刻產(chǎn)生效應(yīng)：通過拮抗RAAS的保鹽作用，增加腎臟電解質(zhì)和水的排泄。二者對全身脈管系統(tǒng)的滲透壓、細胞生長及分化、甚至心肌肥厚也有調(diào)節(jié)作用。越來越多證據(jù)顯

5、示三種利鈉肽不僅是循環(huán)激素，也可作為自分泌和或旁分泌因子發(fā)揮抗心肌肥厚和纖維化作用。GC-A基因敲除(KO)小鼠表現(xiàn)為高血壓、心室肥厚和心肌纖維化。有研究顯示該小鼠的心臟局部腎素一血管緊張素系統(tǒng)上調(diào)，其心室重構(gòu)可通過早期基因剔出或藥物阻斷血管緊張素Ⅱ受體1(AT1)得以改善，這說明GC-A基因敲除后心臟表型改變有賴于AT1途徑。最近研究發(fā)現(xiàn)，醛固酮合成酶CYP11B2可在心臟表達，那么，醛固酮-MR途徑是否在GC-A KO小鼠心臟重構(gòu)中

6、發(fā)揮了作用還不清楚。 轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)是一種局部產(chǎn)生的與各種組織器官的纖維化有關(guān)的多功能細胞因子，通過旁分泌或自分泌的方式，可以刺激成纖維細胞的增生、ECM的沉積及心肌細胞的肥大。許多研究顯示TGF-β1與PASS在纖維化發(fā)生發(fā)展過程中相互關(guān)聯(lián)，在介導(dǎo)血管緊張素Ⅱ所致心肌肥厚和纖維化反應(yīng)中具有重要作用。本研究對TGF-β1在GC-A基因敲除小鼠心臟表達進行研究，以明確其在醛固酮-MR所致心臟重構(gòu)中的介導(dǎo)作用。

7、 依普利酮為一種新型口服高選擇性鹽皮質(zhì)激素受體(豫)拮抗劑，通過競爭性抑制醛固酮與MR結(jié)合發(fā)揮作用。臨床及動物實驗研究均顯示了其在高血壓和心力衰竭治療中的有益作用。本實驗利用GC-A KO小鼠模型觀察了它對心室重構(gòu)的作用，并對其相關(guān)分子機制進行探討。 第一部分依普利酮對GC-A KO小鼠心室重構(gòu)的作用 目的：探討依普利酮對GC-A KO小鼠心室重構(gòu)的作用。 方法：(1)首先進行小鼠基因型鑒定。(2)21只清潔級1

8、2周齡GC-A KO雄性小鼠分成空白對照組(c-KO，n=6)、依普利酮組(e-KO，n=7)與肼苯噠嗪組(h-KO，n=7)。依普利酮通過飼料給予(約每天100mg/kg)；肼苯噠嗪通過飲用水給予(50mg/L，約每天10mg/kg)。每周測量小鼠清醒狀態(tài)下的尾動脈壓(BP)及心率(HR)，同時每周測體重1次。小鼠于16周齡時采用腹主動脈抽血法處死，計算心臟與體重比值(HW/BW)；從心底到心尖部心臟橫分為兩部分，心底部分進行常規(guī)包埋

9、和制片，進行masson三色染色：心尖部分快速置于液態(tài)氮中，然后儲存于-80℃冷凍箱，用于mRNA分析。利用圖像分析系統(tǒng)測量心肌膠原容積分數(shù)(CVF)和心肌血管周圍膠原面積和管腔面積之比(PVCA)。每組隨機取3張切片，每張心肌切片標本均隨機取20個視野進行測量，計算平均值。7只WT雄性小鼠只用測定血壓、心率及組織學(xué)等分析。(4)所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(-x±s)表示，不同組間比較采用方差分析，應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行分析，

10、p<0.05為差異有顯著性意義。 結(jié)果： 1.心室重構(gòu)指標檢測：與野生組比較，空白對照組收縮壓、心臟重量/體質(zhì)量、心肌膠原容積分數(shù)、心肌血管周圍膠原面積/管腔面積均顯著升高(P<0.01)。與空白對照組比較，依普利酮組上述4項指標均顯著下降(P<0.05或0.01)；肼苯噠嗪組收縮壓明顯下降(P<0.01)，心臟重量/體質(zhì)量、心肌膠原容積分數(shù)、心肌血管周圍膠原面積/管腔面積則明顯升高(P<0.05)。 2.心肌纖

11、維化情況：與空白對照組比較，依普利酮治療4周后小鼠心肌纖維化得到改善，心臟重量/體質(zhì)量、心肌膠原容積分數(shù)、心肌血管周圍膠原面積/管腔面積3項量化指標均降低；肼苯噠嗪治療4周后表現(xiàn)為心肌纖維化加重，3項量化指標相應(yīng)增加。 上述結(jié)果表明GC-A KO小鼠表現(xiàn)為高血壓、心室肥厚和纖維化；依普利酮可獨立于血壓改善GC-A KO小鼠心室重構(gòu)。 第二部分小鼠心肌膠原纖維Ⅰ、膠原纖維Ⅲ及TGF-β1mRNA表達及依普利酮的影響

12、 目的：觀察依普利酮對GC-A KO小鼠心肌心肌膠原纖維Ⅰ、膠原纖維Ⅲ及TGF-β1mRNA表達的影響。 方法：本研究動物分組、用藥及心肌取材方法見第一部分。采用TRIZOL(invitrogen公司)法常規(guī)提取心肌總RNA，用反轉(zhuǎn)錄酶法在ABIPRISM 7700 PCR儀上實時定量檢測心肌膠原纖維Ⅰ、膠原纖維Ⅲ及TGF-β1mRNA在心肌組織表達。以GAPDH mRNA的表達作為內(nèi)參照。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(-x±s)表

13、示，不同組間比較采用方差分析，應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行分析，p<0.05為差異有顯著性意義。 結(jié)果： 1.與野生組比較，GC-A基因敲除的各組小鼠心肌膠原纖維Ⅰ、膠原纖維Ⅲ及TGF-β1mRNA的表達均明顯升高(P<0.05或0.01)。 2.與空白對照組比較，依普利酮治療4周后小鼠心肌膠原纖維Ⅰ、膠原纖維Ⅲ及TGF-β1的mRNA表達均下降；肼苯噠嗪治療4周后三者mRNA的表達均升高。 本研究

14、中依普利酮組膠原纖維Ⅰ和膠原纖維Ⅲ的表達降低，與此相一致，TGF-β1表達低下，而肼苯噠嗪具有相反作用，這表明醛固酮對心室重構(gòu)的作用可能是通過TGF-β1介導(dǎo)的。 第三部分小鼠心肌醛固酮合成酶(CYP11B2)、心鈉肽(ANP)和腦鈉肽(BNP)mRNA表達及依普利酮的影響 目的：觀察GC-A KO小鼠心肌CYP11B2、ANP和BNP mRNA表達及依普利酮的影響。 方法：本研究動物分組、用藥及心肌取材方法見第

15、一部分。采用TRIZOL(invitrogen公司)法常規(guī)提取心肌總RNA，實時定量PCR法檢測CYP11B2、ANP和BNP mRNA在心肌組織表達。以GAPDH mRNA的表達作為內(nèi)參照。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(-x±s)表示，不同組間比較采用方差分析，應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行分析，p<0.05為差異有顯著性意義。 結(jié)果： 1.在野生和GC-A KO小鼠的心肌均未檢測到CYP11B2mRNA的表達。

16、 2.與野生組比較，GC-A KO的各組小鼠心肌ANP及BNPmRNA的表達均明顯升高(P<0.05或0.01)。 3.與對照組比較，依普利酮治療4周后GC-A KO小鼠心肌ANP和BNP的mRNA表達均下降；肼苯噠嗪治療4周后GC-A KO小鼠心肌ANP和BNPmRNA的表達均升高。 結(jié)論： 1.GC-A KO小鼠表現(xiàn)為高血壓、心室肥厚和纖維化。 2.高選擇性MR拮抗劑依普利酮可獨立于血壓改善GC-A