“溫、清、引”三法調(diào)節(jié)移植小鼠造血干細胞歸巢及GVHD作用.pdf

1、研究背景及目的： 異基因造血干細胞移植(allogeneichematopoieticstemcelltransplantation，allo-HSCT)是治愈惡性血液病的最有效方法，但移植后出現(xiàn)的植入失敗(graftfailure,RF)、移植物抗宿主病(graftversushostdisease,GVHD)等并發(fā)癥影響了其治療效果。目前針對上述并發(fā)癥的治療方案效果有限，二次移植或供者淋巴細胞再輸注是RF的挽救性治療方法，但

2、這給患者帶來更大的移植風險，移植成功的機率更小。無論是急性移植物抗宿主病(acutegraftversushostdisease，aGVHD)，或是慢性移植物抗宿主病(chronicgraftversushostdisease,cGVHD)，糖皮質(zhì)激素和環(huán)孢素都是一線治療藥物，但有效率50～60％，而耐藥患者只有5～30％，新型免疫抑制劑的應用，或去除T細胞等方法，可減少aGVHD的發(fā)生，但相應地增加了感染和復發(fā)的機會，患者的長期生存率

3、并無明顯改善。因此如何有效解決上述難題，提高移植成功率，是移植界學者關注的焦點。中醫(yī)藥所具有的整體辨證和低副作用等特點和優(yōu)勢，可望成為解決上述問題的方法之一。本研究的目的，通過具有不同功效的方劑作用于不同的移植動物模型，探索和建立一種有效干預和調(diào)節(jié)造血干細胞歸巢和GVHD的中醫(yī)藥綜合方案，為解決移植難題打下基礎。 實驗研究 本文開展了溫陽補腎法調(diào)節(jié)移植小鼠造血干細胞歸巢、涼血解毒法干預異體移植小鼠aGVHD、引火歸元法干

4、預單倍體移植小鼠cGVHD等三個方面的研究，現(xiàn)分述如下： 一、溫陽補腎法調(diào)節(jié)小鼠造血干細胞的歸巢 本課題以轉(zhuǎn)GFP基因的Balb/c熒光小鼠作為供鼠，以普通Balb/c小鼠為受鼠，進行造血干細胞移植。移植前受鼠給予60co全身照射，劑量為9.0Gy，照射后6小時內(nèi)尾靜脈輸注骨髓細胞8×106個/0.5ml。移植后隨機分為5組，每組18只，分別為參附Ⅰ組、參附Ⅱ組、參附Ⅲ組、涼血解毒湯組、空白對照組，分別給予參附I湯(紅參

5、30g，熟附子15g)、參附II湯(紅參15g，熟附子15g)、參附III湯(紅參15g，熟附子30g)、涼血解毒湯(羚羊角粉3g(沖)、丹皮10g、赤芍10g、生地10g、貫眾10g、麥冬10g、田七3g、辛夷花10g、蒼耳子10g、甘草6g)以及生理鹽水等灌胃，移植后小鼠移入附帶空氣過濾帽的塑料透明鼠盒中喂養(yǎng)。于移植后第3、7、14天，分別抽取6只小鼠，留取骨髓、外周血、肝臟、皮膚、小腸等標本，用于血常規(guī)、各組織熒光細胞、骨髓sca

6、-1+及其表面CD44及CD62L的表達等指標的檢測。 結(jié)論：參附湯促進造血干細胞歸巢的作用是通過提高造血干細胞表面粘附分子CD44及CD62L的表達，使干細胞緊密穩(wěn)定地粘附、穿行骨髓血竇內(nèi)皮，順利到達骨髓微環(huán)境，重建造血。這與人參味甘性溫，大補元氣，附子辛甘大熱，回陽益火等功效有關，經(jīng)二者配伍，則陽氣充足，激發(fā)、推動造血干細胞歸巢的動力充足，可有力地促進和推動造血干細胞的歸巢。 二、涼血解毒法干預異體移植小鼠aGVHD

7、 本課題以清潔級Balb/c雄性小鼠作為供鼠，以清潔級C57BL/6雌性小鼠為受鼠，進行異基因骨髓移植。移植前C57BL/6小鼠給予60co全身照射，劑量為9.0Gy，照射后4小鼠內(nèi)尾靜脈輸注骨髓細胞8×107個，只+脾細胞8×107個/只。移植后的小鼠隨機分為4組(單純照射組除外)，分別為安腦片組、桂附地黃丸組、小柴胡顆粒組、aGVHD空白組，每組10只。分別給予安腦片藥液(哈爾濱東方制藥生產(chǎn)，薄膜衣片，0.5g/片，由人工牛

8、黃、水牛角濃縮粉、豬膽汁粉、黃連、黃芩、郁金、珍珠母、珍珠、雄黃、冰片、朱砂、薄荷腦等藥物組成)、桂附地黃丸藥液(河南省宛西制藥生產(chǎn)，濃縮丸，3g/8粒，由干地黃、山藥、山茱萸(酒制)、澤瀉、茯苓、牡丹皮、肉桂、炮附子組成)、小柴胡顆粒(廣州白云山制藥生產(chǎn)，濃縮丸，3g/8丸，由柴胡、當歸、白芍、炒白術(shù)、茯苓、薄荷、生姜、炙甘草組成)以及生理鹽水等灌胃，移植后小鼠移入附帶空氣過濾帽的塑料透明鼠盒中喂養(yǎng)。于移植后第30天，斷頸處死，留取骨

9、髓、外周血、肝臟、皮膚、小腸等標本，用于血常規(guī)、骨髓有核細胞計數(shù)、組織學、供受鼠混合淋巴細胞培養(yǎng)等指標的檢測。 結(jié)論：安腦片可有效減輕異基因移植小鼠aGVHD的癥狀和程度，延長小鼠存活時間，改善組織病理，抑制混合淋巴細胞反應，調(diào)控T淋巴細胞增殖，從而證實了涼血解毒法在aGVHD的治療作用。 為探討安腦片的干預aGVHD的機理，本文還開展了ELASA法檢測外周血清Th1/Th2比例，免疫組化觀察病理組織Th1/Th2的表達

10、等研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：aGVHD小鼠血清及病理組織中Th1/Th2的比例均是倒置的，病理組織中IFN-γ的表達呈現(xiàn)強陽性反應，而IL-10的表達呈現(xiàn)弱陽性或陰性反應，經(jīng)安腦片干預后，血清及病理組織中IL-10的濃度提高，IFN-γ水平下降，與空白組相比，差異顯著(P=0.000)，提示安腦片可糾正aGVHD小鼠T細胞亞群的紊亂，調(diào)節(jié)Th1/Th2間的平衡。從免疫組化的總體評分上，aGVHD小鼠肝臟、小腸、皮膚4.64±0.35、4.24±1

11、.01、3.46±0.12，總分為14.11±1.21，安腦片組1.17±0.51、1.35±0.31、1.41±0.16，總分為3.93±0.72，兩者差異有顯著性意義(P=0.001)。由此得出：調(diào)節(jié)aGVHD小鼠體內(nèi)Th1/Th2間的平衡，誘導免疫耐受，減少因TH1類細胞因子分泌過多而造成的GVHD損害，是安腦片干預aGVHD的機理之一。 三、引火歸元法干預單倍體移植小鼠cGVHD 本課題以近交系清潔Balb/c雄

12、性小鼠作為供鼠，以其子代清潔級CB6F1雌性小鼠為受鼠，進行單倍體骨髓移植。移植前CB6F1小鼠給予60co全身照射，劑量為9.5Gy，照射后4小時內(nèi)尾靜脈輸注骨髓細胞8×106個/只+脾細胞4.5×107個/只。移植后的小鼠隨機分為4組(單純照射組除外)，分別為桂附地黃丸組、安腦片組、小柴胡顆粒組、cGVHD空白組，每組24只。分別給予桂附地黃丸藥液(河南省宛西制藥生產(chǎn)，濃縮丸，3g/8粒，由干地黃、山藥、山茱萸(酒制)、澤瀉、茯苓、

13、牡丹皮、肉桂、炮附子組成)、安腦片藥液(哈爾濱東方制藥生產(chǎn)，薄膜衣片，0.5g/片，由人工牛黃、水牛角濃縮粉、豬膽汁粉、黃連、黃芩、郁金、珍珠母、珍珠、雄黃、冰片、朱砂、薄荷腦等藥物組成)、小柴胡顆粒(廣州白云山制藥生產(chǎn)，濃縮丸，3g/8丸，由柴胡、當歸、白芍、炒白術(shù)、茯苓、薄荷、生姜、炙甘草組成)以及生理鹽水等灌胃，移植后小鼠移入附帶空氣過濾帽的塑料透明鼠盒中喂養(yǎng)。于移植后第7、14、30、100天，隨機抽取6只小鼠，留取骨髓、外周血

14、、肝臟、皮膚、小腸等標本，用于骨髓有核細胞計數(shù)、骨髓造血組織容量、組織學、GeneScan分析小鼠T細胞克隆等指標的檢測。 結(jié)論：桂附地黃丸可改善或消除TCR的優(yōu)勢表達，這一作用可能與桂附地黃丸減輕同種異型抗原的刺激有關。桂附地黃丸的干預效果是明顯的。 為探討桂附地黃丸的干預機理，本文還開展了流式細胞儀檢測CD4+/CD8+比例、ELASA法檢測Th1/Th2比例等研究。研究表明：桂附地黃丸干預cGVHD的機制之一是通過

15、調(diào)節(jié)cGVHD小鼠體內(nèi)血清及組織Th1/Th2間的平衡來實現(xiàn)的。 全文小結(jié)： 1、具有溫陽補腎作用的參附湯能夠促進造血干細胞的歸巢，其促進造血干細胞歸巢的效果與附子的劑量相關，而提高造血干細胞表面粘附分子CD44及CD62L的表達水平是其促進造血干細胞歸巢的作用機制之一。 2、具有涼血解毒作用的安腦片可有效減輕異體移植小鼠aGVHD的癥狀和程度，延長小鼠存活時間，改善組織病理，抑制混合淋巴細胞反應和殺傷活性，調(diào)控

16、T淋巴細胞增殖，誘導免疫耐受。其干預作用是通過如下機制實現(xiàn)的：通過調(diào)節(jié)aGVHD小鼠體內(nèi)Th1/Th2間的平衡，誘導免疫耐受，減少因TH1類細胞因子分泌過多而造成的GVHD損害。 3、具有引火歸元作用的桂附地黃丸可延長cGVHD小鼠的存活時間，改善組織病理，減輕cGVHD的癥狀和程度，減少T細胞的寡克隆增殖，促進T細胞增殖的多樣化。調(diào)節(jié)了CD4+/CD8+、Th1/Th2間的平衡是它干預cGVHD效果的機制之一。 4、綜

17、合上述研究成果，初步建立中醫(yī)藥干預造血干細胞移植的綜合治療方案：即根據(jù)移植后造血干細胞歸巢、aGVHD和cGVHD的不同時期，先后實施溫、清、引三法，溫陽補腎法促進造血干細胞的歸巢：aGVHD初期實施涼血解毒、后期實施溫陽解毒的方法防治aGVHD；原發(fā)型和復發(fā)型cGVHD，實施引火歸元法，進展型cGVHD，實施補腎解毒法。這就是平衡陰陽法則在移植臨床的具體運用。 創(chuàng)新性： 1、運用中醫(yī)腎精腎氣關系理論、中醫(yī)毒邪理論以及命