缺氧預(yù)適應(yīng)小鼠腦勻漿液對(duì)離體細(xì)胞缺氧耐受性的影響及其可能有效組分的初步研究.pdf

1、本研究通過觀察不同實(shí)驗(yàn)條件對(duì)急性重復(fù)缺氧預(yù)適應(yīng)小鼠模型的影響，建立穩(wěn)定可靠、效果顯著的小鼠缺氧預(yù)適應(yīng)模型。由于動(dòng)物對(duì)缺氧的耐受性個(gè)體差異較大，影響因素較多，因此為便于控制實(shí)驗(yàn)條件和探索增強(qiáng)缺氧耐受性的物質(zhì)特性，本研究采用離體細(xì)胞觀察急性重復(fù)缺氧預(yù)適應(yīng)小鼠腦勻漿液對(duì)離體細(xì)胞缺氧耐受性的影響。在確定急性重復(fù)缺氧預(yù)適應(yīng)小鼠腦勻漿液增強(qiáng)不同離體培養(yǎng)細(xì)胞(PC12、HepG2以及NGF誘導(dǎo)分化的PC12細(xì)胞)缺氧耐受效果和有效濃度的基礎(chǔ)上，以NG

2、F誘導(dǎo)分化的PC12細(xì)胞作為觀察對(duì)象，進(jìn)一步將該提取液分成蛋白部分和非蛋白部分，探討其中存在的增強(qiáng)細(xì)胞缺氧耐受性的可能組分。實(shí)驗(yàn)分三部分進(jìn)行。 方法： 第一部分：急性重復(fù)缺氧預(yù)適應(yīng)小鼠模型的復(fù)制 (1).使小鼠一次性缺氧致死，以觀察小鼠缺氧致死前的變化規(guī)律。 (2).將小鼠連續(xù)4次重復(fù)缺氧，以觀察小鼠每次缺氧耐受時(shí)間的變化。 (3).將小鼠分成2組，均經(jīng)過連續(xù)4次缺氧，2組小鼠每次結(jié)束缺氧的標(biāo)準(zhǔn)分

3、別是呼吸頻率約40次/min或出現(xiàn)第1次喘呼吸，以觀察每次不同時(shí)間缺氧對(duì)小鼠缺氧耐受性的影響。 (4).將小鼠分成2組，均經(jīng)過連續(xù)4次缺氧，2組小鼠每次結(jié)束缺氧的標(biāo)準(zhǔn)分別是第一次喘呼吸或末次喘呼吸，以觀察每次不同時(shí)間缺氧對(duì)小鼠缺氧耐受性的影響。 (5).將小鼠分成4組，均經(jīng)過連續(xù)4次缺氧，但4組小鼠連續(xù)4次缺氧的環(huán)境溫度分別是：9-11℃、13-15℃、17-19℃、21-23℃，以觀察不同環(huán)境溫度對(duì)小鼠缺氧耐受性的影響

4、。 (6).將小鼠分成2組，均經(jīng)連續(xù)4次缺氧，2次缺氧間的操作時(shí)間分別是5-15s或20-30s，以觀察不同復(fù)氧時(shí)間對(duì)小鼠缺氧耐受性的影響。 (7).將連續(xù)4次缺氧的小鼠恢復(fù)常氧，30min后再放回缺氧瓶缺氧1次，以觀察小鼠缺氧耐受性的變化。 第二部分：缺氧預(yù)適應(yīng)小鼠腦勻漿液對(duì)未用NGF誘導(dǎo)分化的PC12細(xì)胞、HepG2細(xì)胞以及NGF誘導(dǎo)分化的PC12細(xì)胞缺氧耐受性的影響 1.以不同濃度的小鼠腦勻漿液分別

5、作用于未用NGF誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞，觀察缺氧24h、48h、72h時(shí)PC12細(xì)胞的活力、LDH透出率、早期凋亡率、晚期凋亡率的變化規(guī)律。 2.以不同濃度的小鼠腦勻漿液分別作用于HepG2細(xì)胞，觀察缺氧24h、48h、72h缺氧時(shí)HepG2細(xì)胞的活力、早期凋亡率、晚期凋亡率的變化規(guī)律。 3.僅以較低濃度范圍小鼠腦勻漿液分別作用于NGF誘導(dǎo)分化的PC12細(xì)胞，觀察缺氧24h、48h、72h時(shí)分化PC12細(xì)胞的活力、LDH透出

6、率，晚期凋亡率的變化規(guī)律，以探索缺氧預(yù)適應(yīng)小鼠腦勻漿液對(duì)缺氧、NGF誘導(dǎo)分化的PC12細(xì)胞起保護(hù)作用的最適濃度。 第三部分：缺氧預(yù)適應(yīng)小鼠腦勻漿液不同組分對(duì)NGF誘導(dǎo)分化的PC12細(xì)胞缺氧耐受性的影響及其可能有效成分的初步探討 (1).以高氯酸除蛋白法制備缺氧預(yù)適應(yīng)小鼠腦勻漿去蛋白液，HPLc法測(cè)定其腺苷含量。用小鼠腦勻漿去蛋白液作用于NGF誘導(dǎo)分化PC12細(xì)胞，以確定去蛋白液對(duì)缺氧的分化PC12細(xì)胞有無保護(hù)作用；以小鼠

7、腦勻漿去蛋白液合并腺苷A1或A2A受體阻斷劑作用于分化PC12細(xì)胞，以確定小鼠腦勻漿去蛋白液的作用是否與腺苷有關(guān)。 (2).透析法除去缺氧預(yù)適應(yīng)小鼠腦勻漿液中小分子物質(zhì)，并觀察透析保留液對(duì)缺氧的分化PC12細(xì)胞有無保護(hù)作用；分別用RT-PCR、Westernblot方法檢測(cè)缺氧預(yù)適應(yīng)小鼠腦組織中VEGFmRNA、VEGF的蛋白水平是否增加。用重組VEGF純品作用于分化PC12細(xì)胞，以確定透析保留液對(duì)分化PC12細(xì)胞的保護(hù)作用是否

8、與VEGF有關(guān)。 結(jié)果與討論： (一)影響急性重復(fù)缺氧模型因素 1.小鼠經(jīng)4次急性重復(fù)缺氧后，每次缺氧耐受時(shí)間顯著增加。這一結(jié)果提示，小鼠在每次缺氧后，均在體內(nèi)產(chǎn)生了增強(qiáng)缺氧耐受性的物質(zhì)，并且各次缺氧后缺氧耐受的物質(zhì)有積累效應(yīng)。 2.在小鼠出現(xiàn)第一次喘呼吸時(shí)將小鼠換入下一個(gè)缺氧瓶與小鼠呼吸頻率在40次/min時(shí)換瓶比較，可顯著提高小鼠每次耐受時(shí)間。這是因?yàn)樾∈笤诤粑l率為40次/min時(shí)，缺氧程度尚未達(dá)到

9、缺氧耐受形成的程度，因此對(duì)缺氧的耐受性也不強(qiáng)，因?yàn)槿毖躅A(yù)適應(yīng)的形成需要足夠程度的缺氧。 3.在小鼠出現(xiàn)第一次喘呼吸時(shí)將小鼠換入下一個(gè)缺氧瓶與小鼠出現(xiàn)末次喘呼吸時(shí)換瓶比較，缺氧耐受時(shí)間無顯著差異。其原因是，不同小鼠喘呼吸次數(shù)不同，有的小鼠喘呼吸3-5次即死亡，有的小鼠喘呼吸卻可達(dá)30次以上，因此小鼠的個(gè)體差異較大，使組間無顯著差異，并且末次喘呼吸難以判斷，以其作為結(jié)束缺氧標(biāo)準(zhǔn)導(dǎo)致小鼠死亡率增加。 4.隨著環(huán)境溫度的增加，小

10、鼠的缺氧耐受時(shí)間顯著降低。這可能是因?yàn)榈蜏乜蓽p少小鼠體內(nèi)有害物質(zhì)的產(chǎn)生、降低代謝，有利于缺氧預(yù)適應(yīng)的形成。 5.每次對(duì)小鼠換瓶操作時(shí)間長(zhǎng)于15s會(huì)顯著降低小鼠的缺氧耐受時(shí)間。其原因可能是復(fù)氧時(shí)間太長(zhǎng)，因?yàn)閺?fù)氧時(shí)間短暫有利于預(yù)適應(yīng)的形成。由于小鼠4次缺氧耐受性的完全消失需要至少30分鐘以上的時(shí)間，因此賦予預(yù)適應(yīng)小鼠缺氧耐受性的物質(zhì)，可能部分對(duì)機(jī)體恢復(fù)常氧供應(yīng)較為敏感，但部分能維持較長(zhǎng)時(shí)間。 (二)缺氧預(yù)適應(yīng)小鼠腦勻漿液對(duì)未

11、用NGF誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞、HepG2細(xì)胞、NGF誘導(dǎo)分化PC12細(xì)胞缺氧耐受性的影響 1.缺氧預(yù)適應(yīng)小鼠腦勻漿液對(duì)缺氧、未用NGF誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞、HepG2細(xì)胞缺氧耐受性的影響是：缺氧預(yù)適應(yīng)小鼠腦勻漿液可顯著提高細(xì)胞對(duì)缺氧的耐受性。在缺氧初期(24h)，較高濃度的保護(hù)作用顯著強(qiáng)于低濃度的保護(hù)作用，這提示缺氧預(yù)適應(yīng)小鼠腦組織中產(chǎn)生了某種或某些可以增強(qiáng)細(xì)胞缺氧耐受性的物質(zhì)或使腦組織中抗缺氧成分表達(dá)增加。隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)，保護(hù)作

12、用下降，高濃度的下降更快。至缺氧72h，高濃度提取液的缺氧損傷作用顯著高于低濃度組，該結(jié)果提示，缺氧預(yù)適應(yīng)小鼠腦組織中可能產(chǎn)生了半衰期較短的抗缺氧物質(zhì)及在高濃度時(shí)才顯示作用的、作用時(shí)間持久的促缺氧細(xì)胞損傷的物質(zhì)，即提示缺氧預(yù)適應(yīng)有著雙相效應(yīng)，缺氧預(yù)適應(yīng)小鼠腦勻漿的作用存在量效關(guān)系和時(shí)間效應(yīng)。為此，在后續(xù)缺氧預(yù)適應(yīng)小鼠腦勻漿液對(duì)分化PC12細(xì)胞的作用研究中，以蛋白濃度對(duì)提取液進(jìn)行定量，并降低實(shí)驗(yàn)中所用提取液的濃度范圍。 2.蛋白終

13、濃度為100.0μg/mL的缺氧預(yù)適應(yīng)小鼠腦勻漿液與同濃度正常小鼠腦勻漿液比較，可顯著增強(qiáng)NGF誘導(dǎo)分化PC12細(xì)胞的缺氧耐受性，并且此濃度的缺氧預(yù)適應(yīng)小鼠腦勻漿液對(duì)分化PC12細(xì)胞未顯示出損傷作用，為增強(qiáng)分化PC12細(xì)胞缺氧耐受性的適合濃度。 (三)缺氧預(yù)適應(yīng)小鼠腦勻漿液不同組分對(duì)NGF誘導(dǎo)分化的PC12細(xì)胞缺氧耐受性的影響及其可能有效成分的初步探討 1.向離體培養(yǎng)細(xì)胞中加入不同濃度的腺苷，隨著腺苷濃度增加，細(xì)胞的缺氧

14、耐受性增高，10.0μmol/L的腺苷的細(xì)胞保護(hù)作用可維持24h。急性4次重復(fù)缺氧可使小鼠腦組織腺苷含量由正常時(shí)的4.49μmol/L，上升至10.62μmol/L。缺氧預(yù)適應(yīng)小鼠腦勻漿去蛋白液只在缺氧的24h內(nèi)顯著增加分化PC12細(xì)胞的缺氧耐受性，腺苷A2A受體阻斷劑可阻斷其保護(hù)作用。正常小鼠腦勻漿去蛋白液對(duì)分化PC12細(xì)胞無保護(hù)作用。因此，缺氧預(yù)適應(yīng)小鼠腦勻漿液的非蛋白組分的抗缺氧作用時(shí)間較短，腺苷可能是其中一個(gè)重要的活性物質(zhì)。

15、 2.在缺氧24h和48h，缺氧預(yù)適應(yīng)小鼠腦勻漿透析保留液與未經(jīng)透析的缺氧預(yù)適應(yīng)小鼠腦勻漿液對(duì)分化PC12細(xì)胞均有保護(hù)作用，且經(jīng)兩種孔徑(3.5kD、7.0kD)透析袋透析的缺氧預(yù)適應(yīng)小鼠腦勻漿透析保留液和未經(jīng)透析的缺氧預(yù)適應(yīng)小鼠腦勻漿液對(duì)缺氧細(xì)胞的保護(hù)作用無顯著差異，說明缺氧預(yù)適應(yīng)小鼠腦組織中起保護(hù)作用的主要是分子量大于7.0kD的蛋白成分。急性重復(fù)缺氧預(yù)適應(yīng)小鼠腦組織中VEGF表達(dá)雖增加，但應(yīng)用重組VEGF直接作用于分化的PC1

16、2細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，不同濃度的VEGF對(duì)NGF誘導(dǎo)分化的、不同缺氧時(shí)間的PC12細(xì)胞均無保護(hù)作用。這一結(jié)果提示：缺氧預(yù)適應(yīng)小鼠腦勻漿液的蛋白組分抗缺氧作用較為持久，其中VEGF表達(dá)量雖增高，但并不參與NGF誘導(dǎo)分化的PC12細(xì)胞的抗缺氧作用。由于缺氧預(yù)適應(yīng)小鼠腦勻漿液的蛋白組分抗缺氧作用時(shí)間持久，提示蛋白質(zhì)組學(xué)方法將是研究其中抗缺氧成分的有效方法，為今后的進(jìn)一步研究提示了方向。 結(jié)論： 1.賦予重復(fù)缺氧小鼠缺氧耐受性的物質(zhì)，部分

17、對(duì)機(jī)體恢復(fù)常氧供應(yīng)較為敏感，部分則能持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間； 2.缺氧預(yù)適應(yīng)小鼠腦勻漿液對(duì)離體缺氧培養(yǎng)細(xì)胞的作用表現(xiàn)為雙相性--缺氧早期，腦勻漿液對(duì)缺氧細(xì)胞具有保護(hù)效應(yīng)，延長(zhǎng)缺氧時(shí)間，其損傷作用逐漸顯現(xiàn)，這種雙相作用存在量效關(guān)系和時(shí)間效應(yīng)； 3.缺氧預(yù)適應(yīng)小鼠腦勻漿液可顯著提高不同來源離體培養(yǎng)細(xì)胞的缺氧耐受性，提示對(duì)缺氧細(xì)胞具有普遍的保護(hù)作用； 4.缺氧預(yù)適應(yīng)小鼠腦勻漿液的蛋白組分抗缺氧作用較為持久，其中VEGF表達(dá)量雖增