靶向Syk的抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎化合物篩選的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景
　　類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）至今尚無有效療法，仍停留于對癥治療。最新研究表明Syk在RA的發(fā)病中起著至關(guān)重要的作用，但通過靶向抗Syk治療RA的研究鮮有報(bào)道。華東理工大學(xué)藥學(xué)院李劍教授課題組偶然發(fā)現(xiàn)一個(gè)小分子化合物HL131012對Syk的活性具有較強(qiáng)的抑制作用，針對HL131012結(jié)構(gòu)，采取傳統(tǒng)藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾手段進(jìn)行了一系列結(jié)構(gòu)優(yōu)化研究，合成4 8個(gè)衍生物，通過激酶抑制活性測試，初步篩選出12種抑制作用較好的小分子化合

2、物，為進(jìn)一步篩選出抗RA生物學(xué)活性較好的小分子化合物，與我們合作本課題的研究。
　　目的
　　檢測這12種Syk抑制劑影響RA滑膜細(xì)胞增殖及炎癥因子釋放的情況，在細(xì)胞、分子水平進(jìn)行藥效比較，篩選出抗RA生物學(xué)活性較好的Syk抑制劑，作為今后開發(fā)治療RA的候選藥物。
　　方法
　　1. RA FLS的培養(yǎng)與鑒定:購入人RA FLS，用含10%胎牛血清的高糖DMEM，于37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取第三代處于對

3、數(shù)生長期的滑膜細(xì)胞，通過倒置顯微鏡觀察其大體結(jié)構(gòu)，流式細(xì)胞儀（FCM）檢測細(xì)胞表面標(biāo)記物 CD55、CD68的表達(dá)，對其類型進(jìn)行鑒定。
　　2. CCK-8比色法檢測不同的Syk抑制劑對RA FLS增殖的影響：取第三代處于對數(shù)生長期的RA FLS，根據(jù)初步篩選出的12種Syk抑制劑，隨機(jī)分成14組。①空白組：10%胎牛血清高糖DMEM+CCK-8；②對照組：FLS+CCK-8；③12個(gè)化合物組：FLS+10μmol/L Syk抑制

4、劑+CCK-8。每組每個(gè)時(shí)間段設(shè)6個(gè)復(fù)孔。用紫外線分光光度計(jì)選用450nm波長測定吸光度（OD值）來測定細(xì)胞增殖反應(yīng)。比較分析抑制滑膜細(xì)胞增殖效果較好的一種或數(shù)種Syk抑制劑。
　　3.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法（ELISA）檢測第二步篩選出的6種Syk抑制劑對RA FLS培養(yǎng)上清液中 IL-6和 MMP-3釋放情況的影響:取第三代處于對數(shù)生長期的滑膜細(xì)胞，根據(jù)第二步篩選出的6種Syk抑制劑，隨機(jī)分成7組：①對照組：FLS+檢測試劑；②6

5、個(gè)化合物組：FLS+10μmol/L Syk抑制劑+檢測試劑。每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔?；ぜ?xì)胞以每孔2×105個(gè)接種于6孔板，培養(yǎng)48h后，用Syk抑制劑孵育48h，取上清液移入1.5mL eppendorf管中，檢測IL-6和MMP-3水平。均按照試劑盒說明書進(jìn)行測定。比較分析抑制滑膜細(xì)胞分泌IL-6和MMP-3效果較好的一種或數(shù)種Syk抑制劑。
　　4.統(tǒng)計(jì)學(xué)以及計(jì)算方法：所有數(shù)據(jù)均采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。正態(tài)分布

6、資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X_±S）表示；多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析；多個(gè)樣本均數(shù)兩兩之間的比較，使用SNK-q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)P=0.001，P<0.001表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)至第三代時(shí)，普通光鏡觀察RA FLS生長形態(tài)均一，胞體呈長梭形并伸出突起；FCM檢測細(xì)胞CD55為陽性、CD68為陰性，符合成纖維樣滑膜細(xì)胞典型形態(tài)學(xué)特征。
　　2.12種Syk抑制劑孵育RA FLS后，通過CCK

7、-8比色法測定吸光度（OD值），反映RA FLS的增殖情況，與對照組進(jìn)行對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有6種Syk抑制劑抑制細(xì)胞增殖效果較滿意，名稱為HL131012，HL131071，HL131072，HL131074，HL131078， HL131087。
　　3.第二步篩選出的6種Syk抑制劑孵育RA FLS后，通過ELISA法測定RA FLS培養(yǎng)上清液中IL-6和MMP-3的釋放情況，與對照組進(jìn)行對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有4種Syk抑制劑抑制滑膜細(xì)

8、胞分泌細(xì)胞因子效果較滿意，名稱為 HL131012，HL131074， HL131078，HL131087。
　　結(jié)論
　　1.成纖維樣滑膜細(xì)胞是研究類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎致病機(jī)制及治療的極有意義的體外細(xì)胞模型。
　　2.部分 Syk抑制劑能抑制滑膜細(xì)胞增殖，名稱為HL131012，HL131071， HL131072，HL131074，HL131078，HL131087。
　　3. HL131012、HL131074能