PCR-DGGE分析高溫制曲中細(xì)菌群落變化的研究.pdf

1、大曲是指含有大量能發(fā)酵的活微生物或酶類的糖化發(fā)酵劑。制曲技術(shù)是我國特有的一份民族遺產(chǎn)。曲是各種白酒香型風(fēng)味的重要成因，不同曲中的微生物種類不同，相應(yīng)白酒的香型也會(huì)不同。
　　 本論文以高溫大曲為研究對(duì)象，采用以PCR-DGGE為主的分子生物學(xué)方法，初步分析了制曲過程中各主要階段的細(xì)菌菌群的變化，為強(qiáng)化大曲發(fā)酵劑的開發(fā)提供了理論依據(jù)。
　　 本論文實(shí)驗(yàn)內(nèi)容主要分為四部分：第一，在提取大曲細(xì)菌總DNA過程中，比較了五種基于不

2、同裂解原理的DNA提取方法的效果，發(fā)現(xiàn)SDS-酶法結(jié)合使用的提取方法，高溫大曲中細(xì)菌總DNA的提取效率最高，且產(chǎn)量和質(zhì)量最好，從而為后期實(shí)驗(yàn)提供良好的DNA模板。第二，由于實(shí)驗(yàn)中采用的引物存在特殊的“GC夾板”結(jié)構(gòu)，本論文對(duì)目的基因的PCR擴(kuò)增方法進(jìn)行了優(yōu)化，比較了不同PCR方法的擴(kuò)增結(jié)果，結(jié)果顯示，采用巢式PCR對(duì)16S rDNA V3區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，不但提高了對(duì)目的產(chǎn)物擴(kuò)增的特異性，同時(shí)也使產(chǎn)量得以提高。第三，在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，首先通過垂直膠

3、電泳對(duì)DGGE變性濃度梯度范圍進(jìn)行了確定，然后采用時(shí)間間隔法選擇了最佳電泳時(shí)間。結(jié)果顯示，變性梯度在30％-55％的范圍內(nèi)樣品的分離效果最佳，同時(shí)確定電泳時(shí)間為10h。第四，通過PCR-DGGE技術(shù)對(duì)制曲過程中細(xì)菌的變化進(jìn)行初步研究，結(jié)果表明：在制曲前期優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群落變化較為突出，菌群結(jié)構(gòu)更替頻繁，主要優(yōu)勢(shì)條帶的相似菌有：Bacillus sp。SSCS14-2，Bacillus galactosidilyticus，Virgibacil

4、lus carmonensis，Thermoactinomycessanguinis，uncultured bacterium，Virgibacillus sp.R-6767，其中后三者在制曲中期消失。從中期到后期優(yōu)勢(shì)條帶相似性較大，菌群群落結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，主要優(yōu)勢(shì)菌為：Bacilluslicheniformis，Virgibacillus carmonensis，Bacillus sp.TAT112，Bacillus galactosi