采用PCR-DGGE方法研究浙江玫瑰醋釀造過程中的微生物多樣性.pdf

1、浙江玫瑰醋是一種復(fù)雜微生物參與的傳統(tǒng)發(fā)酵食品。利用PCR-DGGE技術(shù)研究傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的微生物多樣性，不僅能夠獲得群落中優(yōu)勢種類信息，而且能夠同時(shí)分析多個樣品，從而獲得發(fā)酵過程中復(fù)雜的微生物群落演變規(guī)律。本文通過提取玫瑰醋樣品中的基因組DNA作為模板，對細(xì)菌的16S rDNA V3區(qū)和真菌18S rDN進(jìn)行擴(kuò)增，再將PCR產(chǎn)物用變性梯度凝膠電泳(DGGE)進(jìn)行分析，通過對DGGE圖譜的統(tǒng)計(jì)分析和16S rDNA序列分析研究浙江玫瑰醋中

2、微生物群落結(jié)構(gòu)的組成和演變規(guī)律。 對玫瑰醋樣品中基因組DNA的提取方法進(jìn)行了探索，通過比較發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的CTAB法比試劑盒法更適合食醋中基因組DNA的提取，容易得到高濃度的DNA，較真實(shí)的反映了浙江玫瑰醋中的微生物群落結(jié)構(gòu)和組成。對PCR擴(kuò)增的引物和反應(yīng)程序進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明：(1)帶有“GC發(fā)夾”結(jié)構(gòu)的PCR產(chǎn)物在DGGE分析時(shí)能得到較好的分離效果，而不帶有“GC發(fā)夾”的PCR產(chǎn)物在DGGE膠中由于具有相似的電泳行為不能被分離；(

3、2)降落PCR與普通PCR相比，前者的PCR產(chǎn)物在數(shù)量和特異性方面都較后者好。 利用DGGE垂直膠確定了細(xì)菌和真菌DGGE水平電泳的最佳變性梯度，分別為35％～55％和30％～50％。利用時(shí)間進(jìn)程法確定了DGGE水平電泳的最佳電泳時(shí)間為4h。 對不同發(fā)酵時(shí)間的浙江玫瑰醋樣品中的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行DGGE電泳分析，細(xì)菌和真菌在DGGE中的分散度都非常好，細(xì)菌DGGE指紋圖譜中有10個明顯的主要

4、條帶，真菌DGGE指紋圖譜中有7個較明顯的主要條帶。 將從玫瑰醋中分離純化得到的細(xì)菌與不同發(fā)酵階段混合菌群的DGGE指紋圖譜進(jìn)行條帶匹配分析，發(fā)現(xiàn)條帶A與細(xì)菌An的條帶發(fā)生匹配，在DGGE膠中具有相同的電泳行為，經(jīng)16S rDNA序列分析鑒定為巴氏醋桿菌。對DGGE膠中的其它8個條帶進(jìn)行回收，并通過序列分析建立文庫。再將獲得的16S rDNA序列登陸NCBI與已知序列進(jìn)行比對，得到6個發(fā)酵過程中的優(yōu)勢細(xì)菌，其中醋酸菌2種，分別是

5、巴氏醋桿菌和氧化葡萄糖酸桿菌；乳酸菌5種，分別是腸膜明串珠菌腸膜亞種、羅伊氏乳桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌。真菌條帶的DNA序列由于存在特殊結(jié)構(gòu)無法進(jìn)行分析，尚在鑒定中。 將16SrDNA的序列分析結(jié)果與DGGE指紋圖譜相結(jié)合，進(jìn)一步闡明了浙江玫瑰醋整個發(fā)酵階段的微生物群落演變規(guī)律。整個發(fā)酵過程微生物群落結(jié)構(gòu)由復(fù)雜變?yōu)楹唵危⑶野l(fā)花階段和發(fā)酵階段的微生物群落結(jié)構(gòu)有較明顯的籌異。發(fā)花階段鑒定到的細(xì)菌有腸膜明串珠菌腸

6、膜亞種、羅伊氏乳桿菌、干酪乳桿菌和巴氏醋桿菌4種；發(fā)酵階段鑒定到的細(xì)菌有巴氏醋桿菌、氧化葡萄糖酸桿菌、羅伊氏乳桿菌、保加利亞乳桿菌和嗜酸乳桿菌。腸膜明串珠菌腸膜亞種只在發(fā)酵第9天和第11天的樣品中檢測到。羅伊氏乳桿菌在發(fā)酵第13天至49天的樣品中檢測到，且條帶的亮度隨發(fā)酵的進(jìn)行逐漸減弱。干酪乳桿菌只在發(fā)酵第13天的樣品中被檢測到。嗜酸乳桿菌在發(fā)酵第18天至33天的樣品中檢測到較亮的條帶，隨后條帶的亮度減弱甚至消失。氧化葡萄糖酸桿菌在發(fā)酵