未成熟大鼠實(shí)驗(yàn)性PVL模型的建立及AMPA受體亞單位GluR2和自由基在PVL發(fā)病機(jī)制中的作用探討.pdf

1、目的： 制作新生2日齡大鼠腦白質(zhì)周圍軟化(periventricular leukomalacia，PVL)動物模型，觀察新生2日齡大鼠腦缺氧缺血時(shí)，腦白質(zhì)病理學(xué)光鏡及電鏡改變。 方法： 2日齡SD大鼠隨機(jī)分為模型組和對照組，模型組動物經(jīng)右側(cè)頸總動脈結(jié)扎，吸入6％O<,2>、94％N<,2>混合氣體行低氧處理4h，對照組動物行假手術(shù)。分別在缺氧缺血后12h、24h、48h、72h、7d、14d、28d采用HE染

2、色光鏡觀察腦組織病理變化，電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)改變。 結(jié)果： (1)模型組動物缺氧缺血后12h可見側(cè)腦室旁紋狀體內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞胞體腫脹，48h紋狀體膠質(zhì)細(xì)胞排列紊亂，核固縮變圓，胼胝體細(xì)胞稀疏，72h可見缺氧缺血側(cè)大腦側(cè)腦室旁白質(zhì)呈篩網(wǎng)狀壞死，缺氧缺血后14天SD大鼠可見胼胝體變薄，腦室擴(kuò)大。 (2)缺氧缺血后電鏡觀察早期可見細(xì)胞壞死和凋亡，缺氧缺血后28天可見腦白質(zhì)髓鞘稀疏，神經(jīng)束排列疏松，間隙擴(kuò)大。 結(jié)論：

3、 結(jié)扎新生2日齡SD大鼠右側(cè)頸總動脈及吸入6％O<,2>行低氧處理4h，光鏡和電鏡病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)缺氧缺血后早期有顯著的腦室周圍腦白質(zhì)損害，遠(yuǎn)期可見腦室明顯擴(kuò)大，髓鞘減少，符合PVL彌漫性病理改變的特點(diǎn)。 第二部分未成熟大鼠PVL模型的鑒定 目的： 通過免疫組織化學(xué)和神經(jīng)行為學(xué)評價(jià)來驗(yàn)證新生2日齡大鼠腦缺氧缺血動物模型是否符合PVL相關(guān)改變。 方法： 采用經(jīng)右側(cè)頸總動脈結(jié)扎加缺氧處理的2日齡

4、SD大鼠腦缺氧缺血動物模型，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法觀察新生鼠腦缺氧缺血后72小時(shí)腦白質(zhì)GFAP、B-APP和O4表達(dá)變化，以及缺氧缺血后7天和14天MBP表達(dá)改變；采用懸吊試驗(yàn)、傾斜板試驗(yàn)、曠場試驗(yàn)和圓筒試驗(yàn)評價(jià)2日齡大鼠腦缺氧缺血后28天神經(jīng)行為學(xué)改變。統(tǒng)計(jì)方法采用成組t檢驗(yàn)。 結(jié)果： (1)模型組新生SD大鼠腦白質(zhì)與對照組相比，GFAP陽性染色明顯增強(qiáng)，GFAP陽性細(xì)胞平均直徑較對照組增大，P均<0.05。模型組大鼠B

5、-APP表達(dá)明顯增強(qiáng)，在錐形神經(jīng)元細(xì)胞近端樹突上可見APP的表達(dá)，紋狀體內(nèi)細(xì)胞 APP染色強(qiáng)陽性，形態(tài)呈水珠狀，束狀；側(cè)腦室室管膜旁細(xì)胞APP染色呈束狀陽性，P均<0.05。模型組大鼠腦白質(zhì)內(nèi)可見04陽性標(biāo)記的異常固縮細(xì)胞，04．表達(dá)異常細(xì)胞密度與對照組相比有顯著差異，P<0.05。模型組大鼠MBP染色明顯較對照組減弱，P<0.05。 (2)與對照組相比，懸吊試驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠玻棒懸吊時(shí)間縮短，傾斜板試驗(yàn)轉(zhuǎn)頭時(shí)間延長，圓筒實(shí)驗(yàn)可見

6、有明顯肢體對稱運(yùn)動障礙，曠場試驗(yàn)活動明顯減少，P均<0.05，。 結(jié)論： 新生2日齡SD大鼠腦缺氧缺血模型可見明顯的腦白質(zhì)損害，表現(xiàn)為晚期少突膠質(zhì)細(xì)胞損害，反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生、肥大，髓鞘減少和軸突損害，模型組動物在神經(jīng)行為學(xué)上有明顯異常，符合PVL，病理及行為改變。 第三部分 PVL未成熟大鼠腦白質(zhì)細(xì)胞內(nèi)游離Ca<'2+>含量的檢測 目的： 觀察缺氧缺血新生鼠腦白質(zhì)細(xì)胞內(nèi)游離Ca<'2+>濃

7、度在缺氧后不同時(shí)間點(diǎn)的變化。 方法： 采用經(jīng)右側(cè)頸總動脈結(jié)扎加缺氧處理的2日齡SD大鼠PVL模型，缺氧缺血后12h、24h、48h、72 h分別制備腦白質(zhì)細(xì)胞懸液，用Furo 2／AM熒光探針和雙波長熒光分光光度計(jì)檢測腦白質(zhì)細(xì)胞內(nèi)游離Ca<'2+>濃度變化。統(tǒng)計(jì)方法采用成組t檢驗(yàn)和單因素方差分析。 結(jié)果： PVL組新生SD大鼠腦白質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Ca<'2+>濃度與對照組相比，12小時(shí)開始升高，持續(xù)至72小時(shí)仍

8、高于正常水平，P均<0.05。 結(jié)論： 新生2日齡大鼠缺氧缺血后腦白質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Ca<'2+>濃度顯著增高，隨著時(shí)間的延長增高趨勢越明顯。缺氧缺血后腦白質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Ca<'2+>濃度增高可激活一系列的細(xì)胞損傷途徑，損害細(xì)胞。 第四部分 PVL未成熟大鼠腦白質(zhì)AMPA受體亞單位GluR2在缺氧缺血時(shí)的表達(dá) 目的： 觀察AMPA受體亞單位GluR2在2日齡缺氧缺血新生鼠腦白質(zhì)中的表達(dá)，探討其意義。

9、方法： 采用經(jīng)右側(cè)頸總動脈結(jié)扎加缺氧處理的2日齡SD大鼠PVL模型，應(yīng)用熒光定量PCR方法檢測缺氧缺血后12h、24h、48h、72 h GluR2 mRNA表達(dá)的變化；Western Blot檢測GluR2蛋白含量交化。統(tǒng)計(jì)方法采用秩和檢驗(yàn)和成組t檢驗(yàn)。 結(jié)果： (1)與對照組相比，PVL組新生大鼠腦白質(zhì)GIuR2mRNA在缺氧缺血后24小時(shí)開始降低，持續(xù)到72小時(shí)仍未恢復(fù)正常，P均<0.05，(2)West

10、ern蛋白印跡方法表明PVL組新生大鼠腦白質(zhì)GluR2蛋白含量在缺氧缺血后24h開始降低，72小時(shí)仍明顯低于對照組，P均<0.05。 結(jié)論： 隨著缺氧缺血后時(shí)間的延長，GIuR2mRNA和蛋白質(zhì)含量減少，GIuR2的減少可能導(dǎo)致腦白質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載，損傷細(xì)胞。 第五部分 PVL未成熟大鼠腦白質(zhì)SOD、MDA的變化及托吡醑對腦白質(zhì)的保護(hù)作用 目的： 觀察新生2日齡SD大鼠腦缺氧缺血后腦白質(zhì)SOD

11、、MDA的變化，及加用托吡酯干預(yù)后對腦白質(zhì)的保護(hù)作用 方法： 采用經(jīng)右側(cè)頸總動脈結(jié)扎加缺氧處理的2日齡SD大鼠PVL模型，分別應(yīng)用黃嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法檢測缺氧缺血后12h、24h、48h、72h腦白質(zhì)內(nèi)SOD和MDA變化；加用托吡酯腹腔注射(30mg／kg)5個(gè)半衰期后檢測MDA的改變。統(tǒng)計(jì)方法采用成組t檢驗(yàn)和單因素方差分析。 結(jié)果： (1)PVL各組SOD活性明顯低于相應(yīng)對照組，而MDA含量明

12、顯高于相應(yīng)對照組，P均<0.05。MDA在缺氧缺血后不同時(shí)間點(diǎn)變化趨勢與缺氧缺血后細(xì)胞內(nèi)游離Ca<'2+>濃度變化趨勢一致。 (2)托吡酯干預(yù)組MDA水平明顯低于非干預(yù)組，P<0.05。 結(jié)論： 未成熟鼠腦缺氧缺血后，腦白質(zhì)SOD含量下降，而反映機(jī)體氧化指標(biāo)的MDA隨著缺氧缺血時(shí)間的延長而生成增多，自由基的生成增多可能參與了PVL的發(fā)病過程。托吡酯能保護(hù)腦白質(zhì)，至少部分作用是通過減輕興奮毒性對腦白質(zhì)的損害作用來實(shí)