蒙古冰草抗旱相關(guān)基因MwCP和MwAP2-EREBP的克隆及功能分析.pdf

1、干旱是影響植物生長(zhǎng)的重要非生物脅迫因子，嚴(yán)重影響小麥等作物的產(chǎn)量、質(zhì)量和種植范圍。隨著基因工程的開(kāi)展和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷成熟，克隆植物抗旱相關(guān)基因并利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良作物抗逆性，具有良好的前景。
　　半胱氨酸蛋白酶基因和AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子均是植物體內(nèi)可以響應(yīng)干旱脅迫而表達(dá)的基因，其表達(dá)產(chǎn)物可以降低干旱脅迫對(duì)植物造成的傷害。
　　本研究以蒙古冰草為材料，利用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆了蒙古冰草半胱氨酸蛋白酶基因MwC

2、P和AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子基因MwAP2/EREBP，分析了兩者在干旱脅迫下的時(shí)間特異性和器官特異性表達(dá)模式，并將該兩個(gè)基因?qū)霐M南芥中，初步分析了兩個(gè)基因的抗旱功能。
　　本研究主要得到以下結(jié)果:
　　1.利用RACE技術(shù)，從蒙古冰草中分離出了一個(gè)半胱氨酸蛋白酶基因，并命名為MwCP，Genbank注冊(cè)號(hào)為KP899098。該基因全長(zhǎng)1473bp，含有1個(gè)1134bp的開(kāi)放型閱讀框，編碼377個(gè)氨基酸，N端有24個(gè)氨基

3、酸組成的信號(hào)肽，屬于木瓜蛋白酶C1A家族成員。該基因編碼蛋白屬于親水性穩(wěn)定的分泌性蛋白，二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是α螺旋結(jié)構(gòu)和無(wú)規(guī)則卷曲，三級(jí)結(jié)構(gòu)主要有α螺旋和β折疊、β轉(zhuǎn)角。該基因編碼的氨基酸序列與Genebank中小麥CP蛋白（登錄號(hào):AAW21813.1）具有98％的同源性。RT-PCR結(jié)果表明，MwCP基因受干旱脅迫的誘導(dǎo)而表達(dá)，隨著脅迫時(shí)間的增長(zhǎng)，呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，且該基因的表達(dá)具有時(shí)間特異性和器官特異性。
　　2.構(gòu)建了Mw

4、CP基因的植物表達(dá)載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法獲得了轉(zhuǎn)MwCP基因的擬南芥植株。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行復(fù)水試驗(yàn)及抗旱生理指標(biāo)測(cè)定，初步驗(yàn)證了該基因的抗旱功能。結(jié)果顯示，干旱脅迫復(fù)水后，轉(zhuǎn)MwCP基因擬南芥的存活率是對(duì)照的1.72倍;干旱脅迫后，轉(zhuǎn)MwCP基因擬南芥的游離脯氨酸含量、葉綠素含量、超氧化物岐化酶活性的增加量均高于野生型擬南芥，丙二醛含量增加量低于野生型擬南芥。除超氧化物岐化酶活性外，其他三個(gè)指標(biāo)兩者差異顯著。復(fù)水試驗(yàn)及游離脯氨酸

5、含量、葉綠素含量、丙二醛含量和超氧化物岐化酶活性4個(gè)生理指標(biāo)的綜合測(cè)定結(jié)果表明，導(dǎo)入外源MwCP基因可增強(qiáng)擬南芥抵御干旱脅迫的能力。
　　3.利用RT-PCR和RACE技術(shù)，從蒙古冰草中克隆了一個(gè)AP2/EREBP類轉(zhuǎn)錄因子的全長(zhǎng)cDNA，命名為MwAP2/EREBP，Genbank注冊(cè)號(hào)為KJ534637。序列分析表明MwAP2/EREBP基因全長(zhǎng)1199bp，含有1個(gè)813bp的開(kāi)放型閱讀框，編碼270個(gè)氨基酸，含有一個(gè)由64

6、個(gè)氨基酸殘基組成的AP2保守區(qū)，屬于AP2/EREBP類轉(zhuǎn)錄因子家族。該基因編碼蛋白屬于親水性蛋白，狀態(tài)不穩(wěn)定，定位在細(xì)胞核內(nèi)。編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要組成部分為無(wú)規(guī)則卷曲和α螺旋結(jié)構(gòu)，三級(jí)結(jié)構(gòu)包含1個(gè)α螺旋和3個(gè)β折疊。該基因核酸序列與多枝賴草同源轉(zhuǎn)錄因子基因（登錄號(hào):AFO12475.1）親緣關(guān)系最近。利用半定量RT-PCR技術(shù)分析MwAP2/EREBP基因的表達(dá)結(jié)果表明，該基因的表達(dá)受干旱脅迫的誘導(dǎo)，且該基因的表達(dá)具有時(shí)間特異性和器

7、官特異性。
　　4.構(gòu)建了MwAP2/EREBP基因的植物表達(dá)載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法獲得了轉(zhuǎn)MwAP2/EREBP基因的擬南芥植株。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行復(fù)水試驗(yàn)及抗旱生理指標(biāo)測(cè)定，初步驗(yàn)證了該基因的抗旱功能。結(jié)果顯示，干旱脅迫復(fù)水后，轉(zhuǎn)MwAP2/EREBP基因擬南芥的存活率是對(duì)照的1.33倍;干旱脅迫后，轉(zhuǎn)MwAP2/EREBP基因擬南芥的游離脯氨酸含量、葉綠素含量、超氧化物岐化酶活性的增加量均高于野生型擬南芥，丙二醛含量增