水稻AP2-EREBP轉(zhuǎn)錄因子基因OsDRE和OsRAF的功能分析.pdf

1、AP2是一個(gè)大的轉(zhuǎn)錄因子家族，因其成員含有一個(gè)60-70個(gè)氨基酸殘基的保守結(jié)構(gòu)域即AP2結(jié)構(gòu)域而得名，它們的功能涉及植物花的發(fā)育以及植物對(duì)生物或非生物逆境的應(yīng)答反應(yīng)。根據(jù)它們所含的AP2結(jié)構(gòu)域的數(shù)目，這個(gè)家族可分為AP2亞家族和EREBP亞家族。AP2亞家族成員含兩個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域，EREBP亞家族成員含一個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域。一般來說，AP2亞家族的成員主要參與植物發(fā)育過程的調(diào)控；EREBP亞家族成員則主要參與對(duì)逆境的應(yīng)答反應(yīng)。按照它們響應(yīng)外

2、界刺激的類型和AP2結(jié)構(gòu)域中結(jié)合順式作用元件的核心氨基酸的不同，EREBP亞家族又可分為ERF和CBF/DREB兩大類群，ERF類主要響應(yīng)生物類逆境的誘導(dǎo)，CBF/DREB類則響應(yīng)干旱、低溫等非生物脅迫的刺激。
　　 根據(jù)AP2保守結(jié)構(gòu)域搜索，水稻基因組中一共有147個(gè)AP2/EREBP成員，但其中功能得到證實(shí)的還非常有限。為了解更多AP2基因在植物生長發(fā)育過程中的功能，我們先從水稻基因組數(shù)據(jù)庫中搜索到含有AP2/EREBP結(jié)構(gòu)

3、域的推測基因序列，選擇其中40個(gè)擴(kuò)增并成功擴(kuò)增出31個(gè)，將這些DNA片段點(diǎn)在尼龍膜上，然后用水稻葉片cDNA作模板標(biāo)記探針，與固定在膜上的推測基因雜交。雜交結(jié)果作為選擇基因進(jìn)行功能分析的重要依據(jù)。
　　 OsDRE就是我們選擇進(jìn)行研究的一個(gè)表達(dá)較強(qiáng)的基因。首先，通過RACE克隆得到OsDRE的cDNA全長1589bp，它編碼318個(gè)氨基酸。Blast搜索和保守結(jié)構(gòu)域序列比對(duì)分析以及進(jìn)化樹分析顯示它是一個(gè)新的ERF基因。RT-PC

4、R分析表明該基因在水稻各種組織中表達(dá)量比較一致，而且，OsDRE既不對(duì)植物生長物質(zhì)如乙烯，水楊酸(SA)，茉莉酸甲酯(MJ)，脫落酸(ABA)，赤霉素(GA3)，油菜素內(nèi)酯(BR)的誘導(dǎo)起反應(yīng)，同樣也不響應(yīng)環(huán)境因子如低溫、干旱條件的處理。這些結(jié)果說明OsDRE是一個(gè)不響應(yīng)脅迫相關(guān)因素的誘導(dǎo)的、組成型表達(dá)的水稻基因。用OsDRE的非保守區(qū)域構(gòu)建的RNAi載體轉(zhuǎn)入水稻后未能使轉(zhuǎn)基因水稻產(chǎn)生異常表型，然而，OsDRE在水稻和擬南芥中的過量表達(dá)

5、都導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植物出現(xiàn)植株矮小、開花延遲、生長周期延長以及育性降低等表型，說明OsDRE對(duì)生長和發(fā)育的影響在水稻和擬南芥中是一致的。
　　 基于以上原因，我們選擇在遺傳分析方面有明顯優(yōu)勢(shì)的擬南芥作為材料，對(duì)OsDRE基因功能進(jìn)行研究并得出以下結(jié)論：
　　 (1)瞬時(shí)表達(dá)和隨后的過量表達(dá)證明OsDRE定位于細(xì)胞核中，過量表達(dá)OsDRE引起轉(zhuǎn)基因植株的生長周期變長、抽苔時(shí)間延遲和抽苔時(shí)蓮座葉的數(shù)量增多；
　　 (2)過

6、量表達(dá)OsDRE通過一種不影響細(xì)胞數(shù)量的方式抑制了細(xì)胞的膨脹從而導(dǎo)致植物器官以致整個(gè)植株變小，而且，在此過程中部分器官的形態(tài)也受到了影響；
　　 (3)OsDRE過量表達(dá)能激活已知位于乙烯信號(hào)途徑下游的基因表達(dá)并且轉(zhuǎn)基因植株幼苗在黑暗中出現(xiàn)下胚軸及根縮短變粗的現(xiàn)象，提示OsDRE可能部分參與了乙烯信號(hào)途徑下游的反應(yīng)。
　　 除此之外，我們還初步分析了另一個(gè)EREBP基因，并將其命名為OsRAF。氨基酸序列分析表明該基因與

7、大麥的RAF基因在蛋白水平上相似性最高。Northern雜交結(jié)果進(jìn)一步顯示，與RAF一樣，OsRAF也是根中優(yōu)勢(shì)表達(dá)的基因，并且它的表達(dá)量在乙烯或低溫的誘導(dǎo)下增加。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的觀察和瞬時(shí)表達(dá)表明OsRAF定位于細(xì)胞核中。
　　 綜上所述，對(duì)水稻基因OsDRE和OsRAF的分析表明，OsDRE是一個(gè)新的ERF基因，它不受乙烯等因素的誘導(dǎo)并且過量表達(dá)該基因?qū)е罗D(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)細(xì)胞膨脹受到抑制等一系列的表型。另外，OsRAF在水稻根中