不同部位來源的牙周膜干細胞成骨能力的動物實驗研究.pdf

1、牙周病是牙周組織的一種感染性疾病，據統計，我國有2／3的人患有牙周疾病，是40歲以上人群牙齒缺失的主要原因。它是發(fā)生在牙周支持組織的疾病，包括牙齦，牙骨質，牙周膜，牙槽骨的吸收，破壞和喪失，而后期發(fā)展為牙周病則會引起牙齒松動、移位，咀嚼無力甚至疼痛，最終導致牙齒的脫落脫落和拔除。牙周病治療的目標是去除牙周刺激因素，阻止進一步的牙周附著喪失最終獲得牙周軟硬組織的再生，其中以牙槽骨的修復再生最為關鍵。目前臨床廣泛使用的引導組織再生術雖然對治

2、療牙周病有一定的積極意義，可是還不能夠使牙周組織得到完全修復和再生,缺損部位的組織進行自身修復能力有限。
　　如何實現有效的牙周再生，是學著們一直追求的目標和努力的方向。利用組織工程學研究組織再生的主要內容包括種子細胞的來源，生物載體支架的選擇以及微環(huán)境的構建等三個方面。其中種子細胞的優(yōu)化選擇研究是牙周再生領域組織工程的重要內容之一。
　　通過牙周膜中的不同細胞亞群的定向遷移和分化，牙周組織具有一定的自我修復能力實現。近年來

3、，SeoBM等在健康成人牙周膜單細胞懸液中利用酶消化法分離得到具有形成細胞克隆能力和高度增殖能力的細胞，命名為牙周膜干細胞，為治療牙周病提供了新的方法和思路。牙周膜是連接牙齒和牙槽骨韌帶組織，拔牙時牙周膜斷裂，在牙齒和牙槽窩內都殘留有牙周膜干細胞。那么，拔牙后，牙根表面的牙周膜干細胞和牙槽窩內殘留的牙周膜干細胞否有所不同？他們對牙周再生的作用和效果是否一樣？在應用組織工程學的方法作為種子細胞進行牙周再生的時候，究竟什么位置的牙周膜干細胞

4、更加有效？對于這些問題的研究和回答，無疑將有助于為今后牙周組織再生種子細胞的優(yōu)化選擇打下理論基礎，進一步推動運用組織工程的方法治療牙周疾病的效果。
　　本課題分兩部分，前期主要涉及牙槽窩來源的牙周膜干細胞性質和特點的體外鑒定，而本人主要是利用動物實驗的方法研究關于牙槽窩來源的牙周膜干細胞體內成骨能力。
　　主要內容和結果如下：
　　1、人不同部位來源牙周膜干細胞裸鼠皮下成骨能力的研究
　　首先是兩種不同部位來源的

5、PDLSCs的分離和培養(yǎng)。在拔牙后牙槽窩掛取殘留牙周膜組織，通過組織塊加酶消化法，培養(yǎng)出牙槽窩表面牙周膜表面牙周膜干細胞a-PDLSCs（alveolarbonesurfaceperiodontalligamentstemcells）；用文獻所述的方法，在拔牙后牙根中1/3段掛取牙周膜組織，同樣使用組織塊加酶消化法，培養(yǎng)出牙根表面牙周膜干細胞r-PDLSCs（rootsurfaceperiodontalligamentstemcells

6、）。經過間接免疫磁珠法純化兩種來源的PDLSCs。分別在體外用成骨誘導液進行礦化誘導，兩周后用分別觀察發(fā)現均可形成礦化結節(jié)。通過對茜素紅染色形成的礦化結節(jié)定量分析，發(fā)現a-PDLSCs體外礦化結節(jié)面積大于r-PDLSCs體外礦化結節(jié)的面積，a-PDLSCs礦化結節(jié)面積占視野的8.54％，而r-PDLSCs礦化結節(jié)面積占視野的3.21％，說明a-PDLSCs體外誘導后成骨能力明顯強于r-PDLSCs。
　　接著再將兩種來源PDLSC

7、s分別于CBB復合后，移植入裸鼠皮下，觀察6周，發(fā)現來源于牙根面的r-PDLSCs形成了典型的牙周膜/牙骨質復合體樣結構；而來自于牙槽窩表面的a-PDLSCs主要以骨樣礦化組織為主，可見明顯的骨細胞存在于類骨樣礦化組織中。
　　本實驗說明雖然都是來源于牙周膜組織，但是牙根面的r-PDLSCs與牙槽窩表面的a-PDLSCs在體外成骨誘導能力上不一樣，a-PDLSCs有著更強的礦化能力；而在體內，a-PDLSCs也能夠表現出更強的成骨

8、能力。
　　2、人不同部位來源牙周膜干細胞修復裸鼠顱骨極限缺損能力的研究
　　在實驗第一部分基礎上，得到純化的a-PDLSCs和r-PDLSCs。利用免疫缺陷小鼠，建立其顱骨極限缺損模型，直徑大小為6mm。利用纖維蛋白凝膠作為支架材料，分別復合兩種來源牙周膜干細胞，植入裸鼠顱骨缺損部位，同時將單純不復合種子細胞的纖維蛋白膠作為空白對照組。通過術后0周，5周及10周拍攝Micro-CT及10周后取材進行HE切片組織學觀察。

9、r>　　術后5周，r-PDLSCs及a-PDLSCs顱骨缺損部分均有不同程度的修復，修復面積分別達到19％左右和32％左右，而空白對照組幾乎沒有任何新骨生成。術后10周，r-PDLSCs及a-PDLSCs組修復面積百分比較5周時更多，a-PDLSCs組可達51％左右，而r-PDLSCs組能夠修復36％左右。面積更大的高密度新生骨在缺損區(qū)域的邊緣和中間部分同時出現，新生骨密度更加接近正常骨。
　　10周后取材，HE切片觀察，發(fā)現r-

10、PDLSCs及a-PDLSCs組均有大面積新骨形成，成骨細胞清晰可見，而空白對照組幾乎沒有新骨形成。
　　本實驗r-PDLSCs具有新骨誘導形成的能力，但是a-PDLSCs具有更強的新骨形成能力，在相同時間內可更快更好的完成顱骨極限缺損的修復。是理想的骨組織工程種子細胞。
　　3、比格犬自體不同部位來源牙周膜干細胞介導治療牙周缺損的研究
　　牙周病治療的最終目的就是實現完全的牙周組織再生。本實驗利用自體不同來源的牙周膜

11、干細胞，在雄性比格犬上頜尖牙區(qū)域制作牙周缺損模型，去除頰側及近中側牙槽骨和牙周膜，平整牙根面后，利用纖維蛋白凝膠作為支架材料，分別復合r-PDLSCs及a-PDLSCs，移植入缺損區(qū)域，利用雙源CT觀察牙槽骨再生情況。
　　在術后5周，r-PDLSCs及a-PDLSCs牙周缺損部分均有不同程度的修復和再生，而空白對照組幾乎沒有，r-PDLSCs及a-PDLSCs牙槽骨再生的高度有明顯區(qū)別。r-PDLSCs組牙槽嵴高度約恢復了30％

12、，而a-PDLSCs組牙槽嵴高度恢復了約50％，大于r-PDLSCs組。缺損邊緣和中間部分都可見有新生骨形成，密度相對于正常骨稍低，邊緣區(qū)域新生骨和正常骨有融合。
　　術后10周，r-PDLSCs及a-PDLSCs組牙槽嵴高度恢復均較5周時更多，r-PDLSCs組可達60％左右，而a-PDLSCs組幾乎完全恢復。同時新生牙槽骨骨密度更加接近正常骨。
　　本實驗說明在原位用自體r-PDLSCs及a-PDLSCs修復牙周缺損的時