上皮性卵巢腫瘤相關(guān)微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)及其特性研究.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分：上皮性卵巢腫瘤中微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的存在及其分布特點(diǎn)
　　 目的：研究上皮性卵巢腫瘤中微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的存在及其分布特點(diǎn)，探討從上皮性卵巢腫瘤單細(xì)胞懸液中分離微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的可行性。
　　 方法：(1)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記分子D2-40 相關(guān)免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)15例上皮性卵巢腫瘤（其中惡性10例，交界性5例）中微淋巴管的密度（lymphatic vessels density，

2、LVD）和微淋巴管所占的面積百分比（lymphatic vessels area，LVA）；D2-40/Ki-67 相結(jié)合雙標(biāo)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)有無(wú)增生狀態(tài)的微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞。(2)流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)前述15例上皮性卵巢腫瘤新鮮組織，5例良性上皮性卵巢腫瘤和5例正常卵巢組織新鮮組織中淋巴管內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體-1（(lymphatic vessel endothelialHA receptor-1，LYVE-1）陽(yáng)性細(xì)胞的比例。
　

3、　 結(jié)果：(1)交界性卵巢腫瘤中的LVD 為(13.23±8.26)條/4HP，與惡性腫瘤(14.22±7.21)條/4HP 相比無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。但是惡性上皮性腫瘤中LVA 為（3.52±1.61）%較交界性卵巢腫瘤(2.21±1.42)%明顯升高（P＜0.05）。Ki-67 在D2-40(+)的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞中無(wú)表達(dá)。⑵卵巢上皮腫瘤組織單細(xì)胞懸液中LYVE-1(+)細(xì)胞的比例為2-11%，惡性與交界性組織相比無(wú)顯著

4、統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是比例較正常和良性卵巢腫瘤組織高（P<0.05）。
　　 結(jié)論：惡性和交界性卵巢腫瘤中存在微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，二者之間無(wú)顯著差異。
　　 第二部分：體外分離，培養(yǎng)，鑒定上皮性卵巢腫瘤來(lái)源的微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞及其一般生物學(xué)特點(diǎn)
　　 目的：從交界性和惡性上皮性卵巢腫瘤組織中分離微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，體外進(jìn)行培養(yǎng)，鑒定和純化，研究該細(xì)胞的一般生物學(xué)特性。
　　 方法：⑴膠原酶消化26例新鮮卵巢腫瘤（其中

5、交界性11例和惡性15例）組織得到單細(xì)胞懸液，免疫磁珠分選其中的LYVE-1(+)細(xì)胞體外貼壁進(jìn)行二維和三維培養(yǎng)。⑵應(yīng)用泛內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記分子CD31和多種淋巴內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記分子如Prox-1，D2-40，VEGFR-3和LYVE-1 鑒定該細(xì)胞。⑶持續(xù)傳代培養(yǎng)該細(xì)胞，嘗試不同條件下的效果，探討其生長(zhǎng)的規(guī)律。⑷結(jié)合臨床資料分析影響實(shí)驗(yàn)成功的因素。
　　 結(jié)果：⑴應(yīng)用免疫磁珠技術(shù)可以成功分離到上皮性卵巢腫瘤細(xì)胞中的LYVE-1(+)細(xì)胞

6、并體外培養(yǎng)傳代。⑵該細(xì)胞表達(dá)CD31，Prox-1，D2-40，VEGFR-3和LYVE-1，經(jīng)聯(lián)合鑒定其純度在90%以上。⑶上皮性卵巢腫瘤來(lái)源的微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞可以傳6 代以上并維持基本性狀。⑷實(shí)驗(yàn)的成功率與患者年齡密切相關(guān)，年齡<30歲者成功率顯著升高（P<0.05）。與病理類型無(wú)顯著關(guān)聯(lián)（P>0.05）。
　　 結(jié)論：應(yīng)用免疫磁珠技術(shù)可以從卵巢腫瘤中分離培養(yǎng)微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，該細(xì)胞體外性狀穩(wěn)定，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的研究。

7、r>　　 第三部分：上皮性卵巢腫瘤來(lái)源的微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞及其在體外對(duì)腫瘤細(xì)胞CAOV-3的影響
　　 目的：研究上皮性卵巢腫瘤來(lái)源的微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞在體外對(duì)卵巢癌細(xì)胞株增殖，侵襲和遷移能力的影響及其作用機(jī)制。
　　 方法：⑴分別培養(yǎng)上皮性卵巢腫瘤來(lái)源的腫瘤相關(guān)微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞（tumor associatedlymphatic endothelial cell，TLEC）和正常新生兒真皮來(lái)源的微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞（norm

8、al lymphatic endothelial cell，NLEC）。并收集這兩種細(xì)胞的上清得到相應(yīng)的內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基。⑵分別用這兩種條件培養(yǎng)基干預(yù)生長(zhǎng)旺盛的卵巢癌細(xì)胞系CAOV-3，消化后苔盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)了解其對(duì)腫瘤細(xì)胞增值的影響，Transwell 小室法檢測(cè)干預(yù)后腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力。⑶ RT-PCR和熒光定量PCR檢測(cè)分別受到兩種條件培養(yǎng)基干預(yù)后CAOV-3細(xì)胞MMP-2. MMP-9，TIMP-1，TIMP-2和CXCR-

9、4的表達(dá)水平。⑷明膠酶譜法檢測(cè)TLEC和NLEC對(duì)腫瘤細(xì)胞CAOV-3 分泌轉(zhuǎn)移相關(guān)因子MMP-2和MMP-9的影響。
　　 結(jié)果：⑴ TLEC細(xì)胞條件培養(yǎng)基可以顯著增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力。但是該細(xì)胞對(duì)腫瘤增殖有無(wú)影響尚難以確定。⑵ PCR結(jié)果表明在mRNA 水平受到TLEC 干預(yù)的腫瘤細(xì)胞與受到NLEC 干預(yù)的細(xì)胞相比其表達(dá)MMP-9的表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），同時(shí)TIMP-2的表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）；