GM-CSF基因轉(zhuǎn)染的骨髓基質(zhì)細(xì)胞治療缺血性腦血管病及其機(jī)制研究.pdf

1、缺血性腦血管病(ischemic cerebrovascular disease，ICD)作為一類有著較高致死、致殘率的神經(jīng)科常見疾病嚴(yán)重危害著人類的生命健康，給患者和社會(huì)造成了巨大的負(fù)擔(dān)。目前臨床上治療該病的主要方法是藥物治療，但這些治療并不能有效逆轉(zhuǎn)已發(fā)生梗死的腦組織。因此，迫切需要尋找一種切實(shí)有效的修復(fù)受損腦組織的治療方法以減輕腦缺血損傷，最大程度恢復(fù)神經(jīng)功能缺損。 傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)損傷后，由于內(nèi)在的再生能力差

2、和外在的微環(huán)境的抑制，壞死的神經(jīng)組織不能自行恢復(fù)。成體神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)則打破了這一傳統(tǒng)觀點(diǎn)，給缺血性腦血管病的治療帶來了曙光。目前用于中樞神經(jīng)移植的供體細(xì)胞主要有：胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)；神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)；骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)；臍血干細(xì)胞等。BMSCs是幾年前才被確認(rèn)的成體干細(xì)胞，因其具有取材方便

3、、培養(yǎng)容易、多向分化潛能、易于接受外來基因、可取材于自身不涉及倫理道德問題等等優(yōu)點(diǎn)，成為了醫(yī)學(xué)領(lǐng)域乃至整個(gè)生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。 粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophagecolony-stimulating factor,GM-CSF)是一種常見的多功能造血細(xì)胞因子，它能動(dòng)員骨髓、促進(jìn)造血干細(xì)胞的增殖和分化、抑制白細(xì)胞的凋亡，從而提高外周血中白細(xì)胞的數(shù)目。最近，有多個(gè)學(xué)者報(bào)道GM-CSF具有神

4、經(jīng)保護(hù)作用，它能促進(jìn)神經(jīng)前體細(xì)胞分化、對(duì)抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡并促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)功能的改善。本課題研究?jī)?nèi)容包括外源性GM-CSF誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的BMSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞及其機(jī)制的研究、利用BMSCs為細(xì)胞載體轉(zhuǎn)染GM-CSF基因的研究以及將GM-CSF基因轉(zhuǎn)染的BMSCs移植治療大腦中動(dòng)脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)大鼠模型的療效觀察，并對(duì)GM-CSF基因轉(zhuǎn)染的BMSCs移植治療缺血性腦血管病的作

5、用機(jī)理進(jìn)行了初步探索。 本課題分成以下四個(gè)部分： 第一章：體外培養(yǎng)的大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞可分泌粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子 目的：研究體外培養(yǎng)的大鼠BMSCs可否分泌GM-CSF并觀察BMSCs上GM-CSF受體(GM-CSF receptor，GM-CSFR)表達(dá)情況，為進(jìn)一步探討GM-CSF對(duì)BMSCs的誘導(dǎo)作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)并為后一步的實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。 方法：培養(yǎng)和鑒定BMSCs；采用RT-PCR和EL

6、ISA方法，分別從mRNA和蛋白水平測(cè)定體外培養(yǎng)的BMSCs中GM-CSF的表達(dá)；并采用Western blot和RT-PCR方法檢測(cè)第3、4、5、6代BMSCs上GM-CSFR的表達(dá)。 結(jié)果：RT-PCR檢測(cè)顯示BMSCs中有較弱濃度的GM-CSF mRNA表達(dá)。在蛋白水平，采用ELISA法在培養(yǎng)的第一到第六代BMSCs的培養(yǎng)液和細(xì)胞蛋白中均可檢測(cè)到低濃度的GM-CSF，其中第二代BMSCs的細(xì)胞蛋白中GM-CSF濃度明顯高于

7、其他代(P<0.01)，其余幾代BMSCs的培養(yǎng)液和細(xì)胞蛋白中GM-CSF濃度無顯著差別(P>0.05)。Westem blot和RT-PCR方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)BMSCs上存在豐富的GM-CSFR表達(dá)，各代BMSCs之間GM-CSFR表達(dá)水平無顯著差異(P>0.05)。 結(jié)論：體外培養(yǎng)的大鼠BMSCs可分泌少量的GM-CSF，并有豐富的GM-CSFR表達(dá)。 第二章：外源性GM-CSF促進(jìn)大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞

8、 目的：探索GM-CSF對(duì)BMSCs體外分化為神經(jīng)細(xì)胞的誘導(dǎo)作用及其分子機(jī)制。 方法：培養(yǎng)和鑒定SD大鼠BMSCs，取第五代BMSCs采用外源性GM-CSF進(jìn)行分化誘導(dǎo)。分別于誘導(dǎo)后0h、6h、12h、24h、48h及96h行形態(tài)學(xué)觀察，同時(shí)采用免疫細(xì)胞化學(xué)及RT-PCR等方法觀察BMSCs體外是否表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞特異性抗原標(biāo)志巢蛋白(Nestin)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neurone specific enolase，NS

9、E)和膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)。為了進(jìn)一步探討B(tài)MSCs誘導(dǎo)分化的分子機(jī)制，在上述時(shí)間點(diǎn)采用Westem blot方法檢測(cè)BMSCs中p-CREB/CREB的表達(dá)。使用大鼠成纖維細(xì)胞作為陰性對(duì)照組。 結(jié)果：與未誘導(dǎo)的BMSCs相比，外源性GM-CSF可誘導(dǎo)BMSCs體外橫向分化為突觸明確的神經(jīng)細(xì)胞，出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)，誘導(dǎo)后細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞特異性抗原標(biāo)

10、志Nestin、NSE、GFAP。而陰性對(duì)照組的大鼠成纖維細(xì)胞形態(tài)在同樣誘導(dǎo)條件下則無明顯改變。Western blot發(fā)現(xiàn)給予GM-CSF誘導(dǎo)后6h，BMSCs中p-CREB水平開始增高，12h達(dá)到高峰，而CREB水平在誘導(dǎo)前后無顯著性改變。 結(jié)論：外源性GM-CSF可通過上調(diào)CREB磷酸化水平來誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化。 第三章：Lipofectamine介導(dǎo)的pUMVC1-mGM-CSF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞

11、的實(shí)驗(yàn)研究 目的：觀察脂質(zhì)體法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的大鼠BMSCs的轉(zhuǎn)染效率及外源基因的表達(dá)。 方法：培養(yǎng)和鑒定BMSCs；采用陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine<'TM>2000將pUMVC1-mGM-CSF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到體外培養(yǎng)的BMSCs；相同條件下將攜帶綠色熒光蛋白基因的gWiz<'TM>GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs；分別于轉(zhuǎn)染后0h、6h、12h、24h、48h、96h及7d在熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白基因的表

12、達(dá)來計(jì)算基因轉(zhuǎn)染效率，并按上述時(shí)間點(diǎn)應(yīng)用RT-PCR和ELISA方法分別從mRNA和蛋白水平測(cè)定外源基因的表達(dá)。 結(jié)果：熒光倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后6h細(xì)胞開始表達(dá)綠色熒光蛋白，至48h表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞數(shù)量最多，熒光強(qiáng)度最亮，基因轉(zhuǎn)染效率可達(dá)40％。RT-PCR和ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后6h BMSCs開始出現(xiàn)mGM-CSF mRNA和蛋白表達(dá)，以后逐漸增強(qiáng)至48h最強(qiáng)，到轉(zhuǎn)染后第7d還有較強(qiáng)的表達(dá)。 結(jié)論：B

13、MSCs易于接受外源基因并表達(dá)；陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine<'TM>2000介導(dǎo)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs是較好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法，該方法基因轉(zhuǎn)染效率高，外源基因表達(dá)時(shí)間長(zhǎng)。 第四章：mGM-CSF基因轉(zhuǎn)染的骨髓基質(zhì)細(xì)胞治療缺血性腦血管病 目的：探討GM-CSF基因修飾的BMSCs在大鼠腦梗死周邊區(qū)域局部存活、分化及對(duì)神經(jīng)功能的影響；明確同種異體BMSCs及GM-CSF基因轉(zhuǎn)染的BMSCs移植治療腦梗死的可行性及效果。

14、 方法：健康成年雄性SD大鼠135只隨機(jī)分為假手術(shù)組30只和手術(shù)組105只，手術(shù)組又隨機(jī)分為單純注射培養(yǎng)基ct-MEM組、BMSCs治療組及GM-CSF基因修飾的BMSCs治療組。均用線栓法制作短暫性MCAO模型。假手術(shù)組除不插線外其余步驟同MCAO模型。分離、鑒定SD大鼠BMSCs，取第三代BMSCs進(jìn)行GM-CSF基因轉(zhuǎn)染。于MCAO 24h后采用立體定位儀分別將α-MEM培養(yǎng)基、BMSCs和GM-CSF基因修飾的BMSCs

15、植入到SD大鼠缺血腦組織周邊區(qū)域，移植后第3天、7天和21天行神經(jīng)功能評(píng)分，TTC染色法計(jì)算梗死體積，同時(shí)觀察植入細(xì)胞在局部存活、分化情況，HE染色和TUNEL原位標(biāo)記法定量觀察缺血損傷周邊區(qū)域凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目，免疫組化法觀察缺血損傷周邊區(qū)域微血管密度及海馬區(qū)域原位干細(xì)胞的增殖。 結(jié)果：異體大鼠BMSCs可在缺血腦組織周邊區(qū)域定居、生存并分化為神經(jīng)細(xì)胞。移植后第3天各組之間神經(jīng)功能評(píng)分無顯著性差異(P>0.05)。移植后第7天和

16、21天，與α-MEM組和BMSCs組相比，GM-CSF-BMSCs治療組神經(jīng)功能評(píng)分明顯降低(分別P<0.01，P<0.05)，梗死體積顯著縮小(分別P<0.01，P<0.05)，梗死周邊區(qū)域凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯減少(分別P<0.01，P<0.05)而微血管密度明顯增多(均P<0.05)，海馬區(qū)原位干細(xì)胞的增殖顯著增多(分別P<0.001，P<0.05)。 結(jié)論：同種異體GM-CSF基因修飾BMSCs移植治療腦梗死可行，明顯優(yōu)越于單