中國漢族瘢痕疙瘩家系收集保存及Smad2基因突變檢測.pdf

1、一、研究背景及目的 瘢痕疙瘩是人類特有的一種創(chuàng)傷后病理性瘢痕愈合現(xiàn)象，因其發(fā)病機(jī)理至今仍不甚清楚，所以一直是整形外科研究的熱點(diǎn)。以往的研究結(jié)果表明，瘢痕疙瘩是遺傳易感基因與外源性因素共同作用的結(jié)果，因此明確瘢痕疙瘩易感基因?qū)τ谠\斷和治療具有深遠(yuǎn)意義。疾病家系具有較穩(wěn)定的遺傳背景和典型表型，家系研究是疾病分子遺傳學(xué)研究的重要方法，利用家系標(biāo)本進(jìn)行相關(guān)染色體區(qū)域的定位候選基因克隆對于找到疾病易感基因具有重要價值。 為此我們收

2、集到東北一個瘢痕疙瘩大家系進(jìn)行這方面的研究，此家系規(guī)模大、發(fā)病人數(shù)多，能較好地滿足遺傳病研究對家系的要求，對中國人群瘢痕疙瘩遺傳學(xué)方面的研究，具有較好的代表性。 家系樣本來之不易，如何長期、穩(wěn)定地保存家系資源是家系研究中不可忽視的環(huán)節(jié)。EB病毒是一種廣泛存在的親人類B淋巴細(xì)胞的皰疹病毒，能選擇性轉(zhuǎn)化人類B淋巴細(xì)胞使其成為具有持續(xù)分裂能力的淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞系(LCL)。 因此，運(yùn)用EBV轉(zhuǎn)化技術(shù)建立發(fā)病家系個體的永生化細(xì)胞

3、庫，只經(jīng)一次采樣即可長期保存該家系的完整基因信息，并提供足夠的標(biāo)本來源供持續(xù)研究使用，具有重大科研價值。疾病定位克隆是克隆群體中遺傳疾病相關(guān)基因的一種有效手段。研究人員只要收集到能提供足夠信息的疾病家系標(biāo)本，確定疾病基因位點(diǎn)所在的染色體位置，通過直接篩查在該區(qū)域內(nèi)的候選基因，就可能找到致病基因。課題組前期針對人SMAD蛋白基因所在的15q2231-q23及18q21.1染色體區(qū)域，選擇7個微衛(wèi)星標(biāo)記采用STR連鎖分析的結(jié)果表明，D18S

4、460和D18S467的最大兩點(diǎn)L,OD值分別為2.201和1.507，支持兩標(biāo)記位點(diǎn)與候選基因存在連鎖關(guān)系。因此我們初步推斷此瘢痕疙瘩家系易感基因可能位于18q21.1區(qū)域內(nèi)。根據(jù)NCBI Mapviewer數(shù)據(jù)庫18q21.1區(qū)域內(nèi)基因的具體位置和基因的功能，選擇Smad2基因為我們篩查的候選基因。查找Smad2基因的NCBI Locuslink、NCBI Sequence Viewer等網(wǎng)頁的信息，確定該基因的結(jié)構(gòu)，包括外顯子數(shù)目

5、、長度、是否編碼等等。篩查其所有編碼外顯子，確定是否存在突變，為明確瘢痕疙瘩發(fā)病的分子機(jī)理學(xué)研究打下基礎(chǔ)。 二、研究對象與方法 1．采集中國東北地區(qū)1個5代瘢痕疙瘩家系的臨床資料及所有成員的外周血標(biāo)本，建立個人臨床信息資料檔案(包括已故和無法到訪的成員)。瘢痕疙瘩的診斷由2名具有豐富臨床經(jīng)驗的整形外科醫(yī)師，根據(jù)瘢痕疙瘩臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)(即瘢痕超過原有損傷范圍并向周圍正常皮膚侵犯，或瘢痕病程超過1年仍無自發(fā)消退征象，或術(shù)后瘢痕

6、復(fù)發(fā)者)把家系成員分為瘢痕疙瘩發(fā)病者和未發(fā)病者，對所有發(fā)病和未發(fā)病的家系成員進(jìn)行認(rèn)真的體格檢查、詳細(xì)的病史詢問和準(zhǔn)確的臨床診斷，并對瘢痕疙瘩發(fā)病部位照相取證。根據(jù)收集的臨床資料，繪制家系系譜圖，并對瘢痕疙瘩的遺傳模式進(jìn)行初步的分析。 2．選擇此家系中先證者家庭所在的唯一四代家庭共28人的外周血樣本，利用EB病毒轉(zhuǎn)化外周血B淋巴細(xì)胞并加環(huán)胞霉素抑制T淋巴細(xì)胞建立永生細(xì)胞系的方法，建立此瘢痕疙瘩家系外周血淋巴細(xì)胞永生細(xì)胞庫；并對建系

7、前后及凍存復(fù)蘇傳代后的淋巴細(xì)胞分別進(jìn)行染色體G顯帶核型分析，比較其遺傳性狀的穩(wěn)定性。 3．取家系中4個患者(包括先證者)的外周血為研究對象，以其配偶的外周靜脈血作為正常對照。抽提所有研究對象的外周血基因組DNA。然后以這些基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增Smad2基因每一個編碼外顯子。采用基因測序技術(shù)對Smad2基因所有外顯子進(jìn)行突變檢測。 三、結(jié)果 1．采集到中國東北地區(qū)1個5代瘢痕疙瘩發(fā)病家系的臨床資料及56人

8、的外周血標(biāo)本，遺傳分析發(fā)現(xiàn)此漢族瘢痕疙瘩家系的遺傳模式符合常染色體顯性遺傳伴不完全外顯，且存在表現(xiàn)度差異。臨床表型有逐代減輕趨勢。此家系以自發(fā)發(fā)病為主，初始發(fā)病年齡主要集中在16～25歲之間的青春期，好發(fā)于前胸部和肩背部，病變形態(tài)因發(fā)病部位不同而異，并具有對稱性發(fā)病傾向。 2．用于建立永生化細(xì)胞庫的28例樣本中，27例的淋巴細(xì)胞被成功轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)并建系，凍存1月后的細(xì)胞株復(fù)蘇成功率為100％，表明建系成功。一次建系成功率達(dá)96.4

9、％。細(xì)胞建系前后及凍存復(fù)蘇傳代后分別進(jìn)行染色體G顯帶分析未見異常條帶變化，表明轉(zhuǎn)化后細(xì)胞核型穩(wěn)定，保留了原有的遺傳標(biāo)志。 3．基因測序檢測瘢痕疙瘩家系8個標(biāo)本Smad2基因的1-11外顯子及其鄰近內(nèi)含子均未發(fā)現(xiàn)突變。 四、結(jié)論 1．采集到目前最大的一個漢族瘢痕疙瘩家系的完整資料和外周血樣本，初步遺傳學(xué)分析表明其遺傳模式符合常染色體顯性遺傳伴不完全外顯，但表現(xiàn)度存在差異。 2．首次將EBV轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞技術(shù)用