玉米鞘腐病拮抗菌的分離鑒定、菌劑制備及拮抗基因的克隆.pdf

1、玉米是我國第一大糧食作物，病害一直是影響玉米產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素之一。玉米鞘腐病作為玉米新病害近年來呈現(xiàn)加重和擴(kuò)散趨勢，而目前對(duì)其病菌致病機(jī)理和病害發(fā)生規(guī)律研究起步較晚，生產(chǎn)上也缺乏較有效的防治手段。由于化學(xué)農(nóng)藥的長期不合理且過量使用，產(chǎn)生了諸如水源和土壤污染、農(nóng)藥殘留、病菌抗藥性等問題。本研究擬從土壤中分離篩選拮抗玉米鞘腐病的主要生防菌，摸索其廉價(jià)高效的菌劑劑型，初步探究生防菌的拮抗機(jī)理，期望克隆得到調(diào)控拮抗物質(zhì)分泌的相關(guān)基因，為玉米

2、鞘腐病的生物防治奠定理論基礎(chǔ)，為生防菌的遺傳改良及其合理利用提供科學(xué)依據(jù)和遺傳材料。
　　1.從黃瓜根際土壤中成功獲得了1株對(duì)玉米鞘腐病有拮抗活性的優(yōu)良菌株C16。經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化和16S rDNA分子生物學(xué)鑒定，該菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillusubtilis）。研究發(fā)現(xiàn)，C16菌株傳代數(shù)次后仍具有較強(qiáng)的抑菌活性，且抗菌譜較廣，其代謝產(chǎn)物對(duì)層出鐮孢（Fusarium proliferatum）、禾谷鐮孢（F.gramine

3、arum）和擬輪生鐮孢(F.verticillioides)拮抗活性強(qiáng)，為玉米鞘腐病的防治提供了新的菌種資源。此外，C16菌株對(duì)腐霉菌（Pythium aphanidermatum）、灰葡萄孢（Botrytis cinerea）以及核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）等也均表現(xiàn)出了較強(qiáng)的拮抗活性。
　　2.研制出玉米鞘腐病拮抗菌株C16的粗面粉-硅藻土活體顆粒劑，并利用瓊脂擴(kuò)散-抑菌圈法測定了顆粒劑對(duì)層出鐮孢

4、的拮抗活性，測定了不同貯存溫度對(duì)顆粒劑中活菌數(shù)量及對(duì)玉米層出鐮孢拮抗活性的影響。結(jié)果顯示，顆粒劑中最適載體為硅藻土，其與C16的種子液最適比為1∶2(m∶v)，最適粘合劑和營養(yǎng)添加劑為粗面粉。顆粒劑中活菌數(shù)量和對(duì)玉米層出鐮孢的拮抗活性均呈現(xiàn)“先增后減”的趨勢，貯存7d時(shí)活菌數(shù)和抑菌圈直徑達(dá)最大值，分別為9.6×109cfu/mL和4.9cm;此后逐漸降低。各貯存溫度相比較，25℃下的C16顆粒劑中的活菌數(shù)和拮抗活性均最高，90d時(shí)活菌數(shù)

5、為7.3×108cfu/mL，抑菌圈直徑為2.6cm。因此，選擇25℃貯存C16菌株顆粒劑。
　　3.PCR成功驗(yàn)證了玉米鞘腐病拮抗菌株C16中含有編碼srfAA、srfAB、srfAC、fenA、fenB、ituB的生物合成基因，證實(shí)了Surfactin、Fengycin和Iturin是芽孢桿菌屬產(chǎn)生的脂肽類抗生素。通過比對(duì)，C16菌株的fenA基因與已報(bào)道產(chǎn)Plipastatin而不產(chǎn)Fengycin的B.subtilis16