血管緊張素Ⅱ?qū)π募≈?lián)素表達的影響及其機制研究.pdf

1、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system， RAAS)以及細胞因子的激活在左室重塑和慢性心力衰竭(chronic heart failure， CHF)進展中起重要作用。而在細胞因子的網(wǎng)絡調(diào)控中，脂聯(lián)素(adiponection， APN)等細胞因子在心衰過程中起著重要的作用，它使心衰過程中多種細胞因子的交互作用變得復雜，因而積極探索RAAS與APN在CHF中的關系，可能為心

2、衰的臨床治療另辟蹊徑提供依據(jù)。
　　 血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ， AngⅡ)是RAAS系統(tǒng)的主要活性效應分子，在心室重構(gòu)、CHF的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。其主要生物效應包括誘導心肌細胞肥大、凋亡，促進心肌纖維化等。AngⅡ的生物學作用是通過AngⅡ1型受體(AT1)和AngⅡ2型受體(AT2)介導的。這兩種受體均屬于G蛋白偶聯(lián)受體，但組織分布以及細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導途徑是不相同的。AngⅡ與AT1受體結(jié)合可引起心肌肥

3、厚和細胞外基質(zhì)蛋白的積聚、促進醛固酮分泌等，而AngⅡ與AT2受體結(jié)合則起與AT1受體結(jié)合相反的作用，可使血管擴張、抗平滑肌細胞增殖和參與組織修復等起到保護作用。已有研究證實在心室肥厚、心肌梗死以及心力衰竭時AT2受體表達相對上調(diào)，介導AngⅡ的主要作用。AT2受體在肥大心肌細胞下游的信號轉(zhuǎn)導通路主要有以下4條：磷脂酶C途徑、NO/CGMP途徑、Rho途徑、JAK/STAT途徑。AngⅡ與AT2受體結(jié)合后可激活其下游的NO-CGMP信號

4、轉(zhuǎn)導通路，CGMP可通過CGMP依賴的蛋白激酶(PKG)發(fā)揮擴張血管、抗平滑肌細胞增殖、利鈉等心血管保護作用。
　　 APN是主要由脂肪細胞分泌的一種細胞因子，近幾年的研究顯示，心肌細胞也能合成、分泌APN，心肌細胞分泌的APN可通過自分泌和旁分泌方式調(diào)節(jié)心臟功能和心肌代謝。許多研究表明APN水平在CHF患者中呈明顯升高且主要來源于心臟，升高程度與心臟疾病的嚴重程度呈正相關。還有研究表明心外脂肪可能是APN的來源之一，但心力衰竭

5、時心肌細胞分泌的APN是否是血清APN的來源之一目前國內(nèi)外還沒有文獻報道。最近研究證實AngⅡ可通過激活AT2受體上調(diào)脂肪細胞APN的表達，AT1受體在此過程中不被激活。ANP和BNP是心肌細胞合成和分泌的肽類物質(zhì)，文獻報道二者在心力衰竭時升高，其升高的血漿水平與血漿APN水平呈顯著正相關，APN在CHF中具有與BNP相似并相互協(xié)調(diào)的作用。Tsukamoto等研究證實ANP和BNP可與脂肪細胞表面受體結(jié)合，催化細胞內(nèi)第二信使cGMP的合

6、成，通過CGMP/PKG信號轉(zhuǎn)導途徑誘導脂肪細胞APN表達。在自發(fā)性高血壓大鼠血紅素的上調(diào)升高血漿CGMP水平同樣能誘導血漿APN水平的上調(diào)?；谝陨蠈嶒灱芭R床依據(jù)，我們推測AngⅡ可能通過AT2/NC/cGMP/PKG信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)促進心肌細胞APN表達，在心力衰竭患者神經(jīng)內(nèi)分泌改變中發(fā)揮著作用。
　　 CHF的動物模型有許多種，異丙腎上腺素誘導的CHF模型因其方法簡單，費用低廉以及臨床上與心肌梗死、心力衰竭、心室重構(gòu)極其相似的

7、的病理生理和分子生物學特征在臨床以及實驗研究中得到廣泛應用。急性心肌梗死后心室重構(gòu)是臨床上常見的進行性發(fā)展的病理生理過程。大鼠皮下注射異丙腎上腺素可劑量依賴性的造成心肌片狀或彌漫性壞死，而其冠狀動脈卻不受任何影響。有研究表明，大鼠皮下注射異丙腎上腺素后病理生理學及形態(tài)學的變化與人心肌梗死后的改變極其相似。心肌梗死后導致非對稱性左室重構(gòu)，梗死區(qū)的心肌纖維化、變薄，非梗死區(qū)心肌反應性增厚，心肌節(jié)段變長，使左心室進行性擴張和左心室功能進行性下

8、降，最終導致心力衰竭或猝死的發(fā)生。
　　 APN具有降糖、抗炎、抗動脈粥樣硬化作用，近年研究表明可抑制壓力負荷大鼠心肌肥厚的發(fā)生。已知TNF-α也可由心室肌細胞合成和分泌，心肌細胞分泌的TNF-α可以抑制APN及AdipoR1基因的表達，并也可通過自分泌和旁分泌方式誘導心肌細胞凋亡、心肌纖維化繼發(fā)炎癥反應等在壓力負荷大鼠心臟心室重構(gòu)、心功能異常過程中發(fā)揮重要作用。
　　 已知血管緊張素1型受體系統(tǒng)在調(diào)節(jié)血壓以及高血壓引起

9、的一系列病理過程包括心室重構(gòu)中起著重要作用。血管緊張素受體拮抗劑通過阻斷1型受體可減小心肌梗死面積、改善心功能等。替米沙坦是AT1受體拮抗劑，除了能高效、特異地阻斷AngⅡ1型受體，在受體水平阻斷AngⅡ的對心血管系統(tǒng)的負性作用外，近年研究表明還具有過氧化物酶體增殖物活化受體γ(peroxISOme proliferator-activated receptorγ，PPARγ)激動劑的活性。臨床上廣泛用于高血壓、CHF、糖尿病腎病等的治

10、療。近年研究發(fā)現(xiàn)，替米沙坦可通過激活PPAR-γ調(diào)節(jié)糖脂代謝、抑制炎性因子TNF-α等的表達起到改善心室功能、抑制梗死后心室重構(gòu)作用；替米沙坦可通過激活PPAR-γ以劑量-時間依賴方式增強脂肪組織APN的表達和分泌。ARB還可通過誘導心肌APN的表達抑制病毒性心肌炎大鼠的心室重構(gòu)。但替米沙坦對ISO誘導的心肌重構(gòu)的保護作用是否與心肌APN表達有關還沒有文獻報道。
　　 本研究以培養(yǎng)的新生SD大鼠心肌細胞為研究靶細胞，觀察AngⅡ

11、誘導的心肌細胞APN表達的變化；并探討AT2R/NO/cGMP/PKG信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)在AngⅡ誘導大鼠心肌細胞APN表達過程中的可能作用。以ISO誘導心肌細胞作為損傷心肌細胞模型，ISO皮下注射構(gòu)建心肌損傷后心室重構(gòu)大鼠模型，分別在體外細胞水平和動物整體水平探討替米沙坦抑制損傷后心室重構(gòu)作用與心肌APN表達的關系，并對其細胞分子生物學機制進行深入探討，旨在為臨床診治心力衰竭提供新的理論和實驗依據(jù)。實驗內(nèi)容主要包括以下四部分：
　　

12、 第一部分、AngⅡ?qū)π募〖毎鸄PN表達的影響
　　 目的：觀察AngⅡ?qū)π募〖毎鸄PN表達的影響，探討AngⅡ受體在其中的作用。
　　 方法：(1)采用胰酶消化法和差速貼壁分離法獲取新生大鼠心肌細胞，α-肌動蛋白免疫熒光法進行細胞鑒定。(2)應用實時定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應法(Real-time PCR)、Western Blot方法檢測不同處理組心肌細胞APN mRNA和蛋白的表達量。
　　 結(jié)果：
　

13、　 1.AngⅡ?qū)π募〖毎鸄PN mRNA表達的濃度依賴性：
　　 與對照組相比，AngⅡ(10-8、10-7、10-6mol/L)作用心肌細胞24h，APNmRNA表達量明顯增加(P＜0.05)，10-7mol/L時達高峰(P＜0.01)，10-6mol/L、10-8 mol/L時APN mRNA表達量均低于10-7mol/L組(均P＜0.01)。
　　 2.AngⅡ?qū)π募〖毎鸄PN mRNA表達的時間過程：

14、　　 在無血清白蛋白培養(yǎng)的心肌細胞培養(yǎng)液中加入10-7mol/L AngⅡ后0、2、4、8、12、24、48、72h分別測定心肌細胞APN mRNA表達水平。結(jié)果顯示：對照組(0h)心肌細胞表達少量的APN mRNA，給予AngⅡ2h后，APN mRNA表達量開始增加(P＜0.05)，24h達高峰(P＜0.05)，當時間延長至48h、72h時，APN表達量有下降趨勢，但仍明顯高于對照水平(均P<0.05).
　　 3.AngⅡ

15、1型受體拮抗劑telmisartan(telm)在AngⅡ誘導心肌細胞APNmRNA表達中的作用：
　　 與10-7mol/L AngⅡ組相比，10-7mol/L AngⅡ+10-5mol/L telm組心肌細胞APN mRNA水平顯著增加(P＜0.05)；與對照組相比，10-5mol/L telm組心肌細胞APN mRNA水平明顯增加(P＜0.05)。
　　 4.AngⅡ2型受體拮抗劑PD123319在AngⅡ誘導心肌

16、細胞APN mRNA表達中的作用：
　　 與10-7mol/L AngⅡ組相比，10-7mol/L AngⅡ+10-5mol/L PD123319組心肌細胞APN mRNA水平明顯降低(P＜0.05);10-5mol/L PD123319組心肌細胞APN mRNA的水平與對照組相比無顯著差異(P＞0.05)。
　　 5.PD123319在AngⅡ誘導心肌細胞APN蛋白表達中的作用：
　　 與10-7mol/L A

17、ngⅡ組相比，10-7mol/L AngⅡ+10-5mol/L PD123319組心肌細胞APN蛋白水平明顯降低(P＜0.05);10-5mol/L PD123319組心肌細胞APN蛋白的水平與對照組相比無顯著差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：AngⅡ可上調(diào)心肌細胞APN的表達，且此作用可能是通過AT2R介導的。
　　 第二部分、 NO/CGMP信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)在AngⅡ誘導的大鼠心肌細胞APN表達中的作用
　　

18、目的：觀察NO/CGMP信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)在AngⅡ誘導的大鼠心肌細胞APN表達中的作用
　　 方法：應用實時定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應法(Real-time PCR)、Western Blot方法檢測各處理組心肌細胞APN mRNA和蛋白的表達量。
　　 結(jié)果：
　　 1.NO合成抑制劑L-NAME在AngⅡ誘導心肌細胞APN mRNA表達中的抑制作用：
　　 與10-7mol/L AngⅡ組相比，10-7mo

19、l/L AngⅡ+10-3mol/L L-NAME組心肌細胞APN mRNA水平明顯降低(P＜0.05);10-3mol/LL-NAME組心肌細胞APN mRNA水平與對照組相比無顯著差異(P＞0.05)。
　　 2.cGMP拮抗劑類似物Rp-8-Br-CGMP-S在AngⅡ誘導心肌細胞APNmRNA表達中的抑制作用：
　　 PCR結(jié)果表明，與10-7mol/L AngⅡ組相比，10-7mol/L AngⅡ+10-5mo

20、l/L Rp-8-Br-CGMP-S組心肌細胞APNmRNA水平明顯降低(P＜0.05);10-5mol/L Rp-8-Br-CGMP-S組心肌細胞APN mRNA水平與對照組相比無顯著差異(P＞0.05)。
　　 3.NO供體SNP對心肌細胞APN mRNA表達的影響：
　　 與對照組相比，SNP(10-6、10-5、10-4mol/L)作用心肌細胞24h，心肌細胞APNmRNA表達量較對照組明顯增加，且呈劑量依賴性(

21、P＜0.05、P＜0.01和P＜0.01)，10-4mol/L SNP組的APN mRNA水平明顯高于10-5mol/L和10-6mol/L SNP組(P＜0.05)。
　　 4.cGMP激動劑8-Br-cGMP對心肌細胞APN mRNA表達的影響：
　　 與對照組相比，8-Br-cGMP(10-6、10-5、10-4mol/L)作用心肌細胞24h，心肌細胞APN mRNA表達量較對照組明顯增加，且呈劑量依賴性(P＜0.

22、05、P＜0.01和P＜0.01)，10-4mol/L SNP組的APN mRNA水平明顯高于10-5mol/L和10-6mol/L SNP組(P＜0.05)。
　　 5.Rp-8-Br-CGMP-S在AngⅡ誘導心肌細胞APN蛋白表達的抑制作用：
　　 Western Blot結(jié)果表明，與10-7mol/L AngⅡ組相比，10-7mol/LAngⅡ+10-5mol/L Rp-8-Br-CGMP-S組心肌細胞APN蛋白

23、表達量明顯降低(P＜0.05);10-5mol/LRp-8-Br-CGMP-S組心肌細胞APN蛋白表達量與對照組相比無顯著差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：AngⅡ可能通過AT2R/NO/CGMP/PKG信號轉(zhuǎn)導途徑上調(diào)心肌細胞APN的表達。
　　 第三部分、AngⅡ1型受體拮抗劑替米沙坦對ISO誘導的大鼠心肌細胞APN的影響
　　 目的：觀察替米沙坦對ISO誘導的受損大鼠心肌細胞的保護作用，探討此保護作用與A

24、PN表達的關系。
　　 方法：大鼠心肌細胞用替米沙坦、ISO和選擇性PPAR-γ拮抗劑GW9662單獨或聯(lián)合處理，MTT法觀察細胞活力，乳酸脫氫酶(LDH)法檢測細胞膜通透性及完整性，流式細胞術測定細胞凋亡狀態(tài)，Western Blot方法檢測心肌細胞APN蛋白的表達量。
　　 結(jié)果：
　　 1.替米沙坦對受損心肌細胞活力的影響ISO(10μmol/L)孵育心肌細胞48h，心肌細胞活力較對照組顯著下降（P＜0.0

25、1）；而以Telm(5、10、20μmol/L)預處理心肌細胞1h，再加入ISO共同孵育48h，10、20μmol/L濃度組心肌細胞活力較ISO組明顯增強(P＜0.01)，20μmol/L濃度組心肌細胞活力增強最明顯(P＜0.01）。(Figure1)。說明Telm能有效拮抗ISO誘導的心肌細胞死亡，并呈劑量依賴性。
　　 2.替米沙坦對受損心肌細胞細胞膜通透性的影響 ISO(10μmol/L)孵育心肌細胞48h，心肌細胞外液L

26、DH水平較對照組顯著上升（P＜0.01）；而以Telm(5、10、20μmol/L)預處理心肌細胞1h后，再加入ISO共同孵育48h，各濃度組細胞外液LDH水平均較ISO組明顯下降(P＜0.01)，20μmol/L濃度組降低最明顯（P＜0.01）。(Figure2)。說明Telm能有效保護ISO導致的膜損傷，并呈劑量依賴性。
　　 3.替米沙坦對受損心肌細胞凋亡率的影響 ISO(10μmol/L)孵育心肌細胞48h，心肌細胞凋亡

27、率較對照組顯著上升(P＜0.01）；而以Telm(5、10、20μmol/L)預處理心肌細胞1h后，再加入ISO共同孵育48h，各濃度組心肌細胞凋亡率均較ISO組明顯下降(P＜0.01)，20μmol/L濃度組降低最明顯(P＜0.01）。(Figure3)。說明Telm能有效抑制ISO誘導的心肌細胞凋亡，并呈劑量依賴性。
　　 4.Western blot檢測APN的蛋白表達結(jié)果顯示：與對照組比較，ISO(10μmol/L)組心

28、肌細胞APN蛋白表達顯著減少(P＜0.01);與ISO(10μmol/L)組比較，Telm(20μmol/L)+ISO(10μmol/L)組APN蛋白表達顯著升高(P＜0.01)；而與ISO(10μmol/L)+Telm(20μmol/L)組比較，Telm(20μmol/L)+ISO(10μmol/L)+GW9662(30μmol/L)組APN蛋白表達顯著減少（P＞0.05）。(Figure4)。說明GW9662能拮抗替米沙坦對受損心肌

29、細胞APN蛋白表達的上調(diào)作用。
　　 5.選擇性PPAR-γ拮抗劑GW9662在Telm保護ISO誘導的心肌細胞損傷中的作用
　　 5.1 與ISO(10μmol/L)+Telm(20μmol/L)組比較，Telm(20μmol/L)+ISO(10μmol/L)+GW9662(30μmol/L)組心肌細胞活力顯著下降(P＞0.05)；與ISO(10μmol/L)組比較，Telm(20μmol/L)+ISO(10μmol/

30、L)+GW9662(30μmol/L)組心肌細胞活力無顯著變化(P＞0.05)。(Figure5)。說明GW9662能拮抗替米沙坦對受損心肌細胞活力的影響。
　　 5.2 與ISO(10μmol/L)+Telm(20μmol/L)組比較，Telm(20μmol/L)+ISO(10μmol/L)+GW9662(30μmol/L)組心肌細胞外液LDH水平顯著下降（P＞0.05）；與ISO(10μmol/L)組比較，Telm(20μm

31、ol/L)+ISO(10μmol/L)+GW9662(30μmol/L)組心肌細胞外液LDH水平無顯著變化(P＞0.05)。(Figure6)。說明GW9662能拮抗替米沙坦對受損心肌細胞細胞膜的保護作用。
　　 5.3 與ISO(10μmol/L)+Telm(20μmol/L)組比較，Telm(20μmol/L)+ISO(10μmol/L)+GW9662(30μmol/L)組心肌細胞凋亡率顯著下降(P＞0.05)；與ISO(1

32、0μmol/L)組比較，Telm(20μmol/L)+ISO(10μmol/L)+GW9662(30μmol/L)組心肌細胞凋亡率無顯著變化（P＞0.05）。(Figure7)。說明GW9662能有效拮抗替米沙坦對受損心肌細胞凋亡的抑制作用。
　　 結(jié)論：替米沙坦對ISO誘導的受損大鼠心肌細胞具有的保護作用，其機制可能與激活能啟動APN表達的PPAR-γ有關。
　　 第四部分、替米沙坦對異丙腎上腺素誘導的大鼠心室重構(gòu)過程

33、中心肌APN的影響
　　 目的：觀察替米沙坦對ISO誘導的大鼠心室重構(gòu)的保護作用，探討此保護作用與心肌APN表達的關系。
　　 方法：40只雄性Wistar大鼠隨機分為4組：空白對照組、ISO模型組，替米沙坦+ISO組，替米沙坦組，每組10只。除空白對照組及替米沙坦組外，其余兩組皮下注射異丙腎上腺素(80mg/kg/次)連續(xù)2次構(gòu)建大鼠心肌梗死后心室重構(gòu)模型。連續(xù)給藥8wk后，分別檢測各組大鼠體重(BW)、心臟重量(HW

34、)，左室重量(LVW)，計算心臟重量指數(shù)(HW/BW)、左室重量指數(shù)(LVW/BW);測定左室收縮壓(LVSP)、左室舒張末壓(LVEDP)、左心室壓力上升及下降最大速率(±dp/dtmax)等指標；取心肌組織作病理學檢測；免疫組化、Western Blot、Real-time PCR方法檢測心肌APN、TNF-α的表達量。
　　 結(jié)果：
　　 1.替米沙坦對ISO誘導的大鼠左室和心臟重量指數(shù)的影響
　　 與空白

35、對照組比較，ISO模型組HW/BW、LVW/BW明顯升高(P＜0.05，P＜0.01)；與ISO模型組相比，替米沙坦+ISO組HW/BW、LVW/BW明顯降低(P＜0.05，P＜0.01);與空白對照組比較，替米沙坦組上述指標無顯著改變(P＞0.05)。
　　 2.替米沙坦對ISO誘導的大鼠血流動力學參數(shù)的影響
　　 與空白對照組比較，ISO模型組LVEDP明顯升高(P＜0.01)，而LVSP和±dp/dtmax明顯下降

36、(P＜0.05，P＜0.01)；與ISO模型組比較，替米沙坦+ISO組LVEDP明顯下降(P＜0.05)，LVSP和±dp/dtmax明顯升高(P＜0.05，P＜0.01)；與空白對照組比較，替米沙坦組上述指標無顯著改變（P＞0.05）。
　　 3.替米沙坦對IS0誘導的大鼠心肌肥厚及間質(zhì)纖維化的影響
　　 與空白對照組比較，ISO模型組MD、CVF明顯升高(P＜0.05）；與ISO模型組比較，替米沙坦+ISO組心肌細胞

37、MD、CVF明顯下降(P＜0.05)；與空白對照組比較，替米沙坦組上述指標無顯著改變(P＞0.05)。
　　 4.免疫組織化學染色法檢測替米沙坦對APN、TNF-α蛋白表達的影響
　　 對照組APN表達量較高，TNF-α表達量很少，ISO組APN陽性染色細胞數(shù)明顯減少、TNF-α陽性染色細胞數(shù)明顯增多，主要分布于胞質(zhì)中，說明ISO能顯著抑制APN、促進TNF-α表達；與ISO組比較，替米沙坦+ISO組APN陽性染色細胞數(shù)

38、明顯增多，TNF-α陽性染色細胞數(shù)明顯減少，說明替米沙坦能夠逆轉(zhuǎn)ISO誘導的TNF-α上調(diào)和APN的下調(diào)。
　　 5.Western Blot法檢測替米沙坦對APN、TNF-α蛋白表達的影響
　　 與空白對照組比較，ISO模型組APN蛋白表達明顯下降(P＜0.01)、TNF-α表達明顯升高(P＜0.05);與ISO模型組比較，替米沙坦+ISO組APN蛋白表達明顯升高(P＜0.01)、TNF-α表達明顯下降(P＜0.05)

39、；與空白對照組比較，替米沙坦組上述指標無顯著改變(P＞0.05)。
　　 6.Real-time PCR法檢測替米沙坦對APN、TNF-α mRNA表達的影響
　　 與空白對照組比較，ISO模型組APN mRNA表達明顯下降(P＜0.01)、TNF-α mRNA表達明顯升高(P＜0.05);與ISO模型組比較，替米沙坦+ISO組APN mRNA表達明顯升高(P＜0.01)、TNF-α mRNA表達明顯下降(P＜0.05)