檢測乙型肝炎病毒S區(qū)“α”決定簇145位點(diǎn)突變株方法的建立及應(yīng)用研究.pdf

1、病毒性肝炎是由多種肝炎病毒引起的常見傳染病，具有傳染性強(qiáng)、傳播途徑復(fù)雜、流行面廣泛，發(fā)病率較高等特點(diǎn)。臨床上主要表現(xiàn)為乏力、食欲減退、惡心、嘔吐、肝腫大及肝功能損害，部分病人可有黃疸和發(fā)熱。有些患者出現(xiàn)蕁麻疹、關(guān)節(jié)痛或上呼吸道癥狀。病毒性肝炎呈世界性分布，我國是病毒性肝炎的高發(fā)區(qū)域，其中全國各地人群中乙型肝炎的發(fā)病率最高約為50％-70％。乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)感染所至。HBV屬嗜肝DNA病毒

2、科，為環(huán)狀，雙股DNA病毒，外層是脂蛋白包膜，含乙肝表面抗原(HBsAg)；內(nèi)部是核心，含有核酸及乙肝核心抗原(HBcAg)。對人類血清中HBV的電鏡檢查，顯示三種顆粒：即Dane顆粒、球型顆粒和絲狀顆粒。HBV感染人體肝細(xì)胞后，對肝細(xì)胞并無直接致病作用，而是通過細(xì)胞免疫和體液免疫造成肝細(xì)胞的病毒性免疫損害，并從而引起各種臨床表現(xiàn)。大部分患者呈急性發(fā)病過程，通常于6個(gè)月內(nèi)痊愈；10％-20％患者可演變成慢性肝炎，繼而發(fā)展成肝硬化，甚至肝

3、細(xì)胞癌；90％以上新生兒感染者成為慢性攜帶者或慢性肝炎患者。但值得慶幸的是目前已有乙肝疫苗用于預(yù)防HBV感染，而且事實(shí)證明HB疫苗預(yù)防接種已降低了全球流行區(qū)人群中HBV的攜帶率及急性死亡率，且HB疫苗有極好的安全性。 然而隨著乙肝疫苗普遍推行，對可逃逸HBV中和抗體的表面抗原基因(S基因)變異株感染逐步有所認(rèn)識。有研究報(bào)道，目前在接受乙肝疫苗免疫和肝移植后接受HB免疫球蛋白治療的患者中，不斷發(fā)現(xiàn)HBsAg“α”決定簇突變的病毒，

4、同時(shí)研究表明常規(guī)預(yù)防接種所產(chǎn)生的中和抗體對這些病毒無效。對該變異株進(jìn)行進(jìn)一步的測序發(fā)現(xiàn)，編碼“α”決定簇的核苷酸有點(diǎn)突變(587位G→A)，導(dǎo)致HBVS基因區(qū)145位氨基酸由甘氨酸(GLy)→精氨酸(Arg)；突變發(fā)生的區(qū)域是能與疫苗誘導(dǎo)的抗體相結(jié)合的重要的抗原決定簇區(qū)，因此突變株不能被中和抗體識別，且五年后機(jī)體內(nèi)依舊可以檢測到此突變株，提示這種突變是有復(fù)制能力且遺傳穩(wěn)定的。HBsAg“α”決定簇145位變異株不僅流行廣泛，而且同野生病

5、毒株一樣，具有致病性和傳播能力，而且與肝炎的不良預(yù)后有關(guān)。研究表明，145位點(diǎn)的突變會導(dǎo)致HBsAg抗原性改變，致使臨床上廣泛使用的HBsAg診斷試劑對其無法檢出，造成漏檢。更為嚴(yán)重的是，用現(xiàn)行乙肝疫苗接種產(chǎn)生的抗體不能中和該變異株。在大范圍人群接種乙肝疫苗后，由HBsAg“α”決定簇145位變異株引起的感染，很可能會成為新的公共衛(wèi)生問題。因此，及時(shí)快速準(zhǔn)確地檢測出“α”決定簇突變變異株的感染很有意義。 目前，HBV的變異可通過

6、PCR和DNA測序等技術(shù)來檢測，但這些方法費(fèi)用較高、技術(shù)難度大，尚不適于大量臨床標(biāo)本的分析。HBVS區(qū)145位點(diǎn)變異為HBsAg“α”決定基發(fā)生率較高的變異，因此研究該位點(diǎn)變異的快速檢測方法具有非常重要的意義。在本文中，克隆145位點(diǎn)變異的HBVS基因，制備HBV變異株的診斷抗原，以此制備單克隆抗體，利用單克隆抗體及其多克隆抗體建立了145位突變HBsAg的快速檢測方法，該方法具有較高的檢測特異性及敏感性，有望解決隱性HBV持續(xù)性感染的