細小病毒B19-VP1U保守區(qū)外氮基酸對磷脂酶A2活性的影響.pdf

1、人細小病毒B19于1975年被Yvonne Cossart首次發(fā)現(xiàn)，是感染人的細小病毒之一，且能潛在抑制紅細胞的生成，能引起多種疾病。B19感染具有特異性，其傾向于感染表面具有紅細胞糖苷酯受體的原紅細胞。B19侵入細胞除需要紅細胞糖苷酯受體外還需要輔助受體α5β1整聯(lián)蛋白以及具有活性的自主抗原KU80。不同年齡段的宿主感染B19則表現(xiàn)為不同的臨床癥狀，比如在成年人中，關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)痛以及發(fā)熱癥狀發(fā)生頻率比較高；而在兒童中，貧血癥發(fā)生頻率相

2、對較高。B19的衣殼由結(jié)構(gòu)蛋白VP1和VP2構(gòu)成，除了VP1的N端有額外的227個氨基酸序列外，VP1和VP2其它氨基酸序列相同。研究發(fā)現(xiàn)，VP1特有的227個氨基酸具有磷脂酶A2活性，其中第130-195位氨基酸為酶活性的保守區(qū)域，該保守區(qū)外的氨基酸可能對于形成蛋白質(zhì)正確的三維結(jié)構(gòu)以保持酶的穩(wěn)定及作用底物與酶的中心充分接近非常重要。
　　 B19-VP1U在病毒的生活周期中具有重要的功能，尤其磷脂酶A2活性對病毒的感染是必須的

3、，若病毒缺乏VP1完整序列則病毒不具有感染性并且不能從細胞核轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)，因此，B19WP1U的磷脂酶A2活性在病毒的致病性、誘導(dǎo)自主免疫反應(yīng)及炎癥的發(fā)生具有重要的作用。若把B19-VP1U磷脂酶A2活性部位的關(guān)鍵氨基酸進行突變則會導(dǎo)致酶活的下降或喪失，本實驗主要研究保守區(qū)外氨基酸對酶活性的影響。具體方案如下：
　　 (1)根據(jù)查閱的相關(guān)文獻從VP1u保守區(qū)外氨基酸的N端每隔10個或30個氨基酸進行截短突變，將截短突變的基因片段

4、克隆到載體pMAL-c2x上，構(gòu)建正確的重組載體。小規(guī)模誘導(dǎo)目的蛋白的表達，SDS-PAGE及Western-blot檢測目的蛋白后，大規(guī)模誘導(dǎo)，然后利用Amylose樹脂對目的蛋白進行純化。
　　 (2)根據(jù)相關(guān)文獻及對VP1u相關(guān)序列的分析，從。VP1u保守區(qū)外氨基酸的C端每隔7個或8個氨基酸進行截短突變，將截短突變的基因片段克隆到載體pMAL-c2x上，經(jīng)測序得正確的重組質(zhì)粒。目的蛋白經(jīng)小規(guī)模誘導(dǎo)后，SDS-PAGE及We

5、stern-blot檢測，然后進行大規(guī)模誘導(dǎo)，利用Amylose樹脂對目的蛋白進行純化。
　　 (3)獲得目的蛋白后，用Broadford試劑盒測定目的蛋白的濃度，保證蛋白濃度在0.5mg/ml以上，然后采用相應(yīng)的試劑盒測其酶活，最后分析實驗結(jié)果。
　　 通過測定磷脂酶A2的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)從N端截短12個AA時測的酶的活性值與完整VP1u相比降低了約35％，但截短67個AA時酶的活性就明顯下降了，當(dāng)截短96個AA時酶的

6、活性幾乎喪失，因此推測N端第1-96個AA之間的區(qū)域?qū)γ傅幕钚杂酗@著的影響；C端截短7個AA時對酶的活性沒有顯著影響幾乎與VP1u相同，但截短16個AA時酶的活性就顯著下降了，當(dāng)截短24個AA時酶的活性幾乎喪失，因此推測C端第7-24個AA之間的區(qū)域?qū)γ傅幕钚杂酗@著影響。推測，對保守區(qū)外氨基酸截短突變而造成的磷脂酶A2活性的改變可能與B19-VP1U蛋白的正確的三維構(gòu)象有很大的關(guān)系，因為蛋白質(zhì)要保持活性必須具有完整的三維結(jié)構(gòu)。這些結(jié)果將