HSV-gD2-IL-2融合蛋白疫苗動物免疫的研究.pdf

1、生殖器皰疹主要是由單純皰疹病毒2型(HSV-2)引起的。近年來，生殖器皰疹的發(fā)病率迅速上升，危害性亦日益突出。雖然有效的抗病毒藥物在縮短病程、減輕病情等方面確有較好的療效，但目前尚無特效藥物可最終清除潛伏于神經(jīng)節(jié)內(nèi)的病毒，不能控制其發(fā)生和復(fù)發(fā)，因此研制皰疹病毒疫苗已成為預(yù)防生殖器皰疹感染的關(guān)鍵。 在目前研究的皰疹病毒疫苗中，亞單位疫苗因其安全有效而受到人們的青睞。大量的研究表明，HSV-2的糖蛋白疫苗可用于控制生殖器皰疹的感染和

2、復(fù)發(fā)，其中糖蛋白D是中和抗體、抗體依賴性細(xì)胞毒反應(yīng)(ADCC)和CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的病毒特異性細(xì)胞毒反應(yīng)的靶抗原；而且糖蛋白D的基因序列高度保守，在HSV-1和HSV-2之間存在著高度的同源性，有抗原的交叉反應(yīng)，因此被列為研究HSV疫苗的理想候選抗原。 大量研究證明，免疫佐劑能輔助疫苗產(chǎn)生迅速、持久和高水平的免疫應(yīng)答。近幾年來，國內(nèi)外學(xué)者一直在探索應(yīng)用細(xì)胞因子佐劑來加強(qiáng)亞單位疫苗的免疫效果，并取得了一定的成效，而I

3、L-2作為細(xì)胞因子中的重要一員備受關(guān)注。IL-2是由活化的T淋巴細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子，可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞活化增殖和B淋巴細(xì)胞分泌，激活NK細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞殺傷活性，促進(jìn)CD4+T淋巴細(xì)胞合成分泌γ-IFN等，被認(rèn)為是T細(xì)胞生長因子。目前尚無關(guān)于HSV-2糖蛋白D和IL-2融合蛋白疫苗的報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)在前階段研究的基礎(chǔ)上，在小鼠生殖器皰疹模型中鑒定了我們前階段制備的亞單位疫苗對小鼠的保護(hù)作用。 以往的許多研究都是針對gD基因

4、的部分片段進(jìn)行的，這會造成一些抗原決定簇的丟失，因此本研究采用了gD2的全基因片段。我們首先采用基因克隆的方法將gD2基因片段與rIL-2cDNA片段進(jìn)行融合克隆入大腸桿菌，經(jīng)酶切鑒定后高效表達(dá)，蛋白產(chǎn)物經(jīng)Westernblot鑒定分析后，經(jīng)純化所得到融合蛋白的亞單位疫苗。再進(jìn)一步將此亞單位疫苗進(jìn)行小鼠生殖器皰疹模型的動物實(shí)驗(yàn)，通過小鼠病變嚴(yán)重程度評分，陰道分泌物病毒滴度分析，測定血清中HSV-2-IgG與中和抗體滴度，觀察小鼠陰道組織

5、病理變化及應(yīng)用免疫組化技術(shù)觀察陰道組織中的T細(xì)胞亞群，研究疫苗組與對照組相比，在體液免疫和細(xì)胞免疫方面的不同。以期最終研制出能有效預(yù)防HSV感染和治療復(fù)發(fā)性生殖器皰疹的HSV疫苗。 結(jié)果：1.Westernblot試驗(yàn)證明我們制備的疫苗可以和gD2單克隆抗體結(jié)合，表明了該疫苗為實(shí)驗(yàn)所要獲取的目的蛋白。 2.通過TCID50檢測結(jié)果顯示HSV-2-Sav株病毒毒力良好，可以用于動物接種。 3.PBS組和IL-2組小

6、鼠給予病毒攻擊后6天開始出現(xiàn)臨床癥狀，8天后開始死亡，11天內(nèi)全部死亡。接種gD2-IL-2融合蛋白疫苗組小鼠9天開始出現(xiàn)臨床癥狀，11天開始死亡，死亡9只，病變嚴(yán)重程度評分及死亡率與對照組相比有顯著性差異(P＜0.05)。 4.病毒攻擊后小鼠陰道分泌物行病毒培養(yǎng)結(jié)果顯示：PBS組和IL-2組之間前3天均無顯著性差異(P＞0.05)；疫苗組與PBS組和IL-2組之間第1天無顯著性差異(P＞0.05)，第2天和第3天存在顯著性差異

7、。 5.病毒攻擊后組織病理學(xué)檢查見PBS組和IL-2組小鼠陰道病變炎癥明顯；疫苗組小鼠病變程度明顯減輕，且僅少數(shù)出現(xiàn)。 6.在電鏡下發(fā)現(xiàn)PBS組和IL-2組小鼠陰道上皮細(xì)胞內(nèi)可見病毒樣顆粒；小鼠陰道上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)有所改變。 7.免疫前(即0周)3組HSV-2-IgG與中和抗體滴度均為陰性結(jié)果，無顯著性差異(P＞0.05)。免疫后病毒攻擊前(即9周)PBS組和IL-2組抗體滴度仍為陰性結(jié)果無顯著性差異(P＞0.0

8、5)，疫苗組與其它兩組比較顯示抗體滴度有顯著性差異(P＜0.01)。 8.免疫組化結(jié)果示：PBS組和IL-2組小鼠陰道中CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量較少，散在分布；疫苗組小鼠陰道組織中CD4+、CD8+T數(shù)量較多，以CD4+細(xì)胞增多更為明顯，CD4+/CD8+比例升高。 結(jié)論：1.我們成功建立了小鼠生殖器皰疹動物模型，為今后的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。 2.本研究中用gD2單克隆抗體驗(yàn)證了我們所制備的融合蛋白，表