RNA聚合酶Ⅱ介導(dǎo)的FCV反向遺傳操作系統(tǒng)的建立及RHDV VP60基因的表達(dá).pdf

1、應(yīng)用反向遺傳系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)RNA病毒的拯救，從而在DNA水平上對RNA病毒進(jìn)行遺傳操作，為深入研究RNA病毒的分子生物學(xué)及病毒與宿主的相互作用提供了新的手段。絕大多數(shù)杯狀病毒不能夠在體外培養(yǎng)，嚴(yán)重阻礙了這類病毒的研究，貓杯狀病毒為杯狀病毒科中少數(shù)能在體外培養(yǎng)的病毒之一，本研究選擇貓杯狀病毒CH-GD分離株，克隆其全基因組cDNA，嘗試建立RNA聚合酶Ⅱ介導(dǎo)的FCV反向遺傳系統(tǒng)，拯救含遺傳標(biāo)記的FCV。
　　 1 FCV CH-GD株全

2、長cDNA分子克隆
　　 設(shè)計(jì)并合成了覆蓋FCV CH-GD株基因組的1對引物，以本實(shí)驗(yàn)室保存的含有FCV CH-GD株全長基因組的pUC-FCV質(zhì)粒為模板，采用PCR方法擴(kuò)增FCV全長基因組。通過沉默突變引入一分子標(biāo)記（MluⅠ識別位點(diǎn)）以便于區(qū)分野毒株和拯救毒。改造pCDNA載體，并在其3′端引入核酶（pCDNA-HDVRZ）。將CH-GD株全基因組插入載體，構(gòu)建CH-GD株基因組的全長cDNA克?。╬CDNA-HDVRZ-

3、FCV），并以PCR、限制性內(nèi)切酶酶切和基因組測序等方法對pCDNA-HDVRZ-FCV進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明已成功構(gòu)建了FCV CH-GD株的全長cDNA分子克隆。該克隆不僅含有CH-GD株的全基因組序列，還含有核酶序列和一個分子標(biāo)記（MluⅠ識別位點(diǎn)）.
　　 2.拯救病毒的鑒定
　　 以 pCDNA-HDVRZ-FCV為模板，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法（LipofectamineTM2000）將FCV基因組全長cDNA分子克隆導(dǎo)入

4、F81細(xì)胞，利用聚合酶Ⅱ系統(tǒng)進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)錄。盲傳三代后可觀察到典型的FCV致細(xì)胞病變效應(yīng)。使用RT-PCR方法進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明拯救病毒成功，獲得了感染性cDNA分子克隆。通過對感染性分子克隆分子標(biāo)志的鑒定，排除了自然毒株的污染。
　　 3.RHDV VP60在F81細(xì)胞上的表達(dá)
　　 用KpnⅠ和NotⅠ分別將本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的兩個轉(zhuǎn)移載體和pUC-FCV進(jìn)行雙酶切，采用粘端連接將RHDV VP60基因帶入FCV全基因組中不

5、同位點(diǎn)。成功構(gòu)建了將RHDV VP60插入FCV全基因組中的質(zhì)粒（LC之后和VP1之后）。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將質(zhì)粒導(dǎo)入F81細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48h后，應(yīng)用間接免疫熒光法能夠檢測到RHDV VP60的表達(dá)，繼續(xù)傳代，發(fā)現(xiàn)熒光變?nèi)?，至第七代檢測不到熒光，RT-PCR結(jié)果也為陰性。試驗(yàn)結(jié)果表明，重組病毒可以在F81細(xì)胞中表達(dá)VP60，但是不能形成穩(wěn)定的可感染的重組病毒。
　　 總之，F(xiàn)CV反向遺傳研究系統(tǒng)的建立將為深入研究其功能基因組學(xué)以及致