姜黃素對(duì)SHR視網(wǎng)膜缺血再灌注后細(xì)胞凋亡及p53表達(dá)的影響.pdf

1、目的： 研究自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)視網(wǎng)膜缺血再灌注后細(xì)胞凋亡及p53的表達(dá)，并探討姜黃素對(duì)其變化的影響。 方法： 制作大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注(retinal ischemia reperfusion，RIR)模型，將12周齡雄性SHR隨機(jī)分為假手術(shù)組(SHR-SH)、缺血組(SHR-IR)、姜黃素預(yù)處理組(SHR-CU)，每組又分為再灌注后2、6、24、72 h和7d等五個(gè)亞組，以同周齡血壓正常的雄性WKY大鼠

2、分為同樣組別作為對(duì)照。姜黃素預(yù)處理組劑量為100 mg/kg，均在缺血前1h腹腔給藥。每亞組9只大鼠，分別制備大鼠視網(wǎng)膜石蠟切片、視網(wǎng)膜毛細(xì)血管鋪片和活組織冰凍標(biāo)本。用HE染色觀察大鼠視網(wǎng)膜和視網(wǎng)膜毛細(xì)血管細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口翻譯法(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end-labeling， TUNEL)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，

3、分光光度計(jì)法檢測(cè)視網(wǎng)膜Caspase-3酶表達(dá)活性，兔疫組織化學(xué)過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素染色法(streptavidin-perosidase，SP)法檢測(cè)再灌注后不同時(shí)段視網(wǎng)膜組織中p53蛋白表達(dá)變化。 結(jié)果： (1) HE染色：假手術(shù)組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC)呈單層整齊排列，數(shù)目較多，內(nèi)核層(INL)由3-5層細(xì)胞構(gòu)成，染色深；外核層(ONL)較厚，有8-10層細(xì)胞，排列緊密，染色深，缺血組再灌注6h后RGC

4、和INL細(xì)胞出現(xiàn)排列紊亂，再灌注24 h后上述變化更加明顯，視網(wǎng)膜略水腫，細(xì)胞排列疏松而紊亂，較多RGC呈空泡狀改變，再灌注72 h后水腫減輕，再灌注7d后無明顯水腫，可見RGC數(shù)目減少。缺血組各再灌注點(diǎn)視網(wǎng)膜變化比姜黃素預(yù)處理組明顯。 視網(wǎng)膜毛細(xì)血管自然舒展，網(wǎng)狀交織。內(nèi)皮細(xì)胞核呈長(zhǎng)橢圓形，位于毛細(xì)血管的中央或稍偏位，較周細(xì)胞核略大，周細(xì)胞核呈短橢圓形或圓形，多位于血管分岔處，稍凸出于血管壁，在SHR毛細(xì)血管鋪片上尚可見少量無

5、細(xì)胞毛細(xì)血管網(wǎng)，即管腔內(nèi)無內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞，血管腔大小不均，管壁變形，偶見閉塞。WKY未見此現(xiàn)象。 (2) TUNEL染色：視網(wǎng)膜石蠟切片切片：SHR-SH有明顯凋亡陽性染色，與WKY-SH比較差異有顯著性(P<0.05)。SHR-IR凋亡細(xì)胞明顯增加，以再灌注24 h組凋亡數(shù)最多，之后逐漸下降。視網(wǎng)膜RGC出現(xiàn)最多，INL次之，ONL也有少量陽性染色。WKY-IR比SHR-IR細(xì)胞凋亡數(shù)少，各對(duì)應(yīng)缺血時(shí)間點(diǎn)之間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

6、義。WKY-IR與WKY-SH比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。姜黃素能顯著減少缺血再灌注損傷引起細(xì)胞凋亡，各時(shí)間點(diǎn)SHR-CU組視網(wǎng)膜凋亡細(xì)胞數(shù)分別是SHR-IR組的73.9％，74.0％，69.1％，74.9％，66.6％(P<0.05)； WKY-CU組凋亡細(xì)胞數(shù)分別是WKY-IR組的63.2％，78.7％，57.5％，68.8％，66.2％(P<0.05)。 視網(wǎng)膜毛細(xì)血管鋪片的凋亡表現(xiàn)為：細(xì)胞核棕黃色深染，核膜完整，核

7、中央染色稍淺，近核膜處著色較深，胞核多位于血管壁一側(cè)。SHR-SH有明顯凋亡現(xiàn)象，而WKY-SH毛細(xì)血管幾乎無陽性染色，兩組之間差異有顯著性(P<0.05)。SHR-IR以再灌注24 h后凋亡最多，400倍鏡下細(xì)胞凋亡百分率達(dá)20.72±2.98％，再灌注72h后次之，再灌注2h和7d凋亡較少，但仍較SHR-SH多。WKY-IR比SHR-IR細(xì)胞凋亡數(shù)少，各對(duì)應(yīng)缺血時(shí)間點(diǎn)之間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在缺血再灌注各時(shí)間點(diǎn)，姜黃

8、素預(yù)處理組視網(wǎng)膜毛細(xì)血管凋亡細(xì)胞數(shù)均少于對(duì)應(yīng)的缺血再灌注組(P<0.05)。 (3)視網(wǎng)膜免疫組化：p53蛋白主要在細(xì)胞核表達(dá)，SHR-SH有少量p53蛋白表達(dá)，主要分布在RGC，但各時(shí)間點(diǎn)間無明顯差異(P>0.05)，WKY-SH則無明顯陽性染色，SHR-SH與WKY-SH比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。SHR-IR組再灌注2h后p53表達(dá)開始增多，6h后表達(dá)繼續(xù)上升，在INL和毛細(xì)血管表達(dá)增多，至24 h表達(dá)至高峰，再灌注

9、72 h后p53蛋白表達(dá)開始下降，7d后表達(dá)明顯減少，但與假手術(shù)組比較，差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。WKY-IR也有上述p53蛋白表達(dá)變化曲線，但均少于相同時(shí)間點(diǎn)的SHR-IR(P<0.05)。姜黃素預(yù)處理組p53表達(dá)明顯減少，各時(shí)間點(diǎn)平均光密度值SHR-CU組低于SHR-IR組(P<0.05)，WKY-CU組低于WKY-IR組(P<0.05)。 (4)視網(wǎng)膜Caspase-3酶活性：假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜Caspase

10、-3酶活性無明顯差異，但SHR-SH組Caspase-3酶活性比WKY-SH組高，兩組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。在缺血再灌注組，SHR-IR在再灌注2、6、24和72 h該酶活性要高于SHR-SH組(P<0.05)，但在再灌注7d時(shí)兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。WKY-IR除7d這個(gè)時(shí)間點(diǎn)外，Caspase-3酶活性在其余各時(shí)間點(diǎn)均高于WKY-SH(P<0.05)。SHR-IR在各時(shí)間點(diǎn)的酶活性分別比對(duì)應(yīng)的WKY-IR組高(

11、P<0.05)，但比SHR-CU組低(P<0.05)，其中在7d時(shí)相當(dāng)。姜黃素能降低WKY缺血再灌注后Caspase-3酶活性，在再灌注6h，24 h和72 h Caspase-3酶活性WKY-CU組分別較WKY-IR組降低9.3％，22.8％和18.0％(P<0.05)，在再灌注2h，7d兩組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 結(jié)論： 高血壓狀態(tài)下發(fā)生RIR損傷視網(wǎng)膜和視網(wǎng)膜毛細(xì)血管細(xì)胞凋亡顯著增加，p53表達(dá)增強(qiáng)，且