巖黃連細(xì)胞培養(yǎng)合成生物堿研究.pdf

1、植物細(xì)胞培養(yǎng)被認(rèn)為是解決資源危機(jī)的理想途徑。本論文工作旨在建立巖黃連細(xì)胞培養(yǎng)合成生物堿的技術(shù)方法，主要圍繞巖黃連細(xì)胞培養(yǎng)的建立、生物堿的誘導(dǎo)合成和藥理作用進(jìn)行研究，主要研究結(jié)果如下： 1. 通過篩選外植體、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件建立了巖黃連愈傷組織和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系。結(jié)果表明巖黃連葉片最適合誘導(dǎo)愈傷組織，最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為B5 基本培養(yǎng)基中添加0.5 mg/l 2,4-D 和2 mg/l BA，誘導(dǎo)率為94％。7.5-10％（FW）的接

2、種量對懸浮細(xì)胞培養(yǎng)較為合適，接種量過少會(huì)抑制細(xì)胞生長。B5 和MS 基本培養(yǎng)基均適合細(xì)胞的生長。培養(yǎng)基的最佳初始培養(yǎng)基pH 值為6.0。巖黃連懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的生長周期為24 天，最大生物量出現(xiàn)在第18 天。 2. 建立了分光光度發(fā)測定巖黃連總生物堿含量。結(jié)果表明巖黃連細(xì)胞中生物堿含量低于植株中生物堿含量。以總生物堿含量為指標(biāo)，采用回流提取法和超聲提取法兩種方法對巖黃連細(xì)胞進(jìn)行提取，優(yōu)化提取工藝，發(fā)現(xiàn)兩者之間沒有顯著性差異，回流提取

3、耗時(shí)短，提取效率高于超聲提取法。通過TLC、LC-MS 等方法，對巖黃連細(xì)胞培養(yǎng)中的生物堿成分進(jìn)行鑒定。發(fā)現(xiàn)巖黃連細(xì)胞中主要含有脫氫卡維丁和小檗堿，可能含有新的生物堿成分。建立反相高效液相色譜法同時(shí)測定脫氫卡維丁和小檗堿的含量，檢測方法準(zhǔn)確、可靠。細(xì)胞中脫氫卡維丁含量較植株中含量低，細(xì)胞中可檢測到小檗堿，而植株中沒有檢測到小檗堿。 3. 對巖黃連細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的生長過程和營養(yǎng)物質(zhì)消耗進(jìn)行動(dòng)態(tài)研究。發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液的pH 值在5.0-7.

4、0 之間變化。巖黃連細(xì)胞的生長曲線呈“S”型，細(xì)胞的生長與碳、氮、磷元素的消耗以及生物堿的合成相吻合。大量元素的消耗速率為PO43- > NH4+ > C> NO3-，在大量元素中無機(jī)磷消耗最快。對巖黃連細(xì)胞進(jìn)行搖瓶放大培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)巖黃連細(xì)胞在100-ml 培養(yǎng)體系中生長最快，生物量也最高。 4. 使用來自于黑曲霉細(xì)胞壁多糖成分的真菌誘導(dǎo)子處理巖黃連懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，可提高巖黃連懸浮細(xì)胞培養(yǎng)中生物堿的產(chǎn)量。最佳誘導(dǎo)子濃度是50 mg/

5、l。來源于黑曲霉細(xì)胞壁降解物的真菌誘導(dǎo)子可以誘發(fā)巖黃連細(xì)胞中活性氧的大量產(chǎn)生，提高細(xì)胞中苯丙氨酸解氨酶的活性，引起細(xì)胞死亡，提高可溶性蛋白和次生代謝產(chǎn)物含量。 認(rèn)為黑曲霉真菌誘導(dǎo)子處理可誘發(fā)巖黃連懸浮細(xì)胞發(fā)生防御反應(yīng)，誘導(dǎo)子導(dǎo)致生物堿產(chǎn)量升高也是植物細(xì)胞防御反應(yīng)的一種體現(xiàn)。對Ca2+信號(hào)和H2O2 在真菌誘導(dǎo)子誘發(fā)巖黃連細(xì)胞防御反應(yīng)中的作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)子刺激次生代謝產(chǎn)物的合成是通過Ca2+信號(hào)傳遞并激發(fā)防御反應(yīng)而產(chǎn)生的。誘

6、導(dǎo)子誘導(dǎo)巖黃連細(xì)胞產(chǎn)生的H2O2 可以導(dǎo)致膜脂過氧化，但誘導(dǎo)產(chǎn)生的H2O2 對于生物堿的累積并沒有直接貢獻(xiàn)作用。對JA 在巖黃連細(xì)胞中生物堿的誘導(dǎo)合成中的作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)真菌誘導(dǎo)子處理可以提高巖黃連細(xì)胞中的JA 含量，來啟動(dòng)巖黃連懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中生物堿合成。LOX 抑制劑的加入沒有完全抑制誘導(dǎo)子誘導(dǎo)的生物堿的累積，表明真菌誘導(dǎo)子除了通過十八烷醇途徑激活生物堿合成外，還存在其他的信號(hào)途徑導(dǎo)致生物堿的累積。 5. 通過巖黃連細(xì)胞生物