黃連二步法細(xì)胞懸浮培養(yǎng)及其生物堿含量的測定.pdf

1、黃連為毛莨科(Ranuculaceae)的黃連(Coptis chinensis Franch)、三角葉黃連(Coptisdeloidea C.Y.Cheng et Hsiao)或云連(Coptis teeta Wall)的干燥根莖。黃連根莖含有大量生物堿，對多種疾病有顯著療效，已在臨床上廣泛應(yīng)用。黃連根莖生長極為緩慢，藥源緊缺。應(yīng)用植物細(xì)胞培養(yǎng)以生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物能夠克服化學(xué)合成的不足，以及人工栽培的困難。而由于在植物細(xì)胞的培養(yǎng)過程中，

2、細(xì)胞的生長與其次生代謝產(chǎn)物的合成之間又存在矛盾，而不同培養(yǎng)基對于促進(jìn)細(xì)胞的生長和次生代謝產(chǎn)物的合成有著不同的作用。因此，本實驗在前人研究基礎(chǔ)上，對毛茛科植物黃連采用二步培養(yǎng)法進(jìn)行深入探索，為黃連獲取藥用次生代謝產(chǎn)物、大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)、以及加速植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)商業(yè)化生產(chǎn)進(jìn)程等提供有效的途徑和方法。對兩步培養(yǎng)法中的基本培養(yǎng)基更改為6，7-V1和6，7-v2，為兩種培養(yǎng)基分別設(shè)置不同濃度的激素，分別進(jìn)行細(xì)胞生長和小檗堿含量測定，以期得到最佳的

3、激素濃度組合。結(jié)果如下：
　　 1.黃連外植體的消毒：選取黃連的葉片作為外植體，首先用三年生的黃連葉片對黃連愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)的消毒方法進(jìn)行了預(yù)備實驗，從而得到最適消毒方法和消毒時間。具體為：先用軟毛刷將塵埃刷除，絨毛較多的黃連葉片用皂液浸泡5min左右，用清水洗去皂液，清水沖洗2h左右，用滅菌消毒過的吸水紙吸干表面水分，再用75％酒精浸泡30s，取出后用加有1～2滴吐溫-80的0.1％HgCl2溶液浸泡12min，無菌水沖洗6次

4、。
　　 2.初代培養(yǎng)：誘導(dǎo)黃連葉片愈傷組織的最適激素濃度配比均為6，7-V+2，4-D1.0mg/L+KT0.2mg/L，接種后黃連葉片愈傷組織在第32d開始啟動，出愈率為89.5％。
　　 3.繼代培養(yǎng)：從愈傷組織開始出現(xiàn)50d左右在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)。為了防止褐變以及材料滲出過多水分的影響，每隔15d左右轉(zhuǎn)接一次。
　　 4.愈傷組織狀態(tài)的調(diào)控：灰白色水漬狀的愈傷組織，可以單獨加入玉米素(ZT)，或者

5、是配以6-BA和NAA等激素繼代4次左右，愈傷組織的狀態(tài)可以得到明顯改善。對于淺黃色、黃色或者淺綠色、綠色類愈傷組織，加入ZT0.05 mg/L+6-BA0.5 mg/L，或者配以水解酪蛋白(CH500)，繼代2到3次以后，愈傷組織的狀態(tài)也能得到較好的改善。
　　 5.二步法細(xì)胞懸浮培養(yǎng)：用一步法培養(yǎng)黃連葉片的懸浮細(xì)胞時，最佳激素濃度配比為6，7-V1+2，4-D1.5 mg/L+KT0.2 mg/L；收獲的細(xì)胞鮮重為182.9

6、2 g/L，干重為21.58 g/L，其總生物堿的含量為8.3％。用二步法培養(yǎng)黃連葉片的懸浮細(xì)胞時，最佳激素濃度配比為6，7-V2+NAA1.5 mg/L+KT0.2 mg/L；收獲的細(xì)胞鮮重為129.01 g/L，干重為17.89 g/L，其總生物堿的含量為13.8％。兩種方法培養(yǎng)出的細(xì)胞對于細(xì)胞生長而言，一步法的細(xì)胞生長指標(biāo)高于二步法；而對于生物堿的含量而言，雖然各生物堿的含量不是成比例增加的，但是二步法的生物堿含量顯然高于一步法。