巖黃連中小檗堿型生物堿生物合成途徑相關(guān)基因的研究及藜蘆中甾體.pdf

1、第一部分巖黃連中小檗堿型生物堿生物合成途徑相關(guān)基因的研究巖黃連為罌粟科植物石生黃堇(Corydalis saxicola Bunting)的全草，是一種名貴的中藥材主要分布在貴州，云南，四川，廣西等省，對(duì)環(huán)境條件要求十分苛刻，野生狀態(tài)下只生長(zhǎng)在石灰?guī)r地區(qū)陰濕的巖洞口，被列入中國(guó)南部瀕危植物名錄。巖黃連具有清熱解毒、利濕、止痛止血之功效，在臨床上主要藥理活性有抗菌，抗病毒，抗癌。
　　 巖黃連中的活性成分為小檗堿型生物堿類化合物,

2、而這類化合物具有潛在的抗HBV 活性和肝保護(hù)活性。
　　 本文對(duì)巖黃連中小檗堿類生物堿生物合成途徑中的相關(guān)酶基因進(jìn)行了克隆、表達(dá)及功能分析。
　　 巖黃連中(S)-四氫小檗堿氧化酶的克隆，表達(dá)及功能分析(S)-四氫小檗堿氧化酶是小檗堿生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，是黃連小檗堿的合成途徑中最后一個(gè)酶，將(S)-四氫小檗堿氧化成小檗堿。通過(guò)RACE 獲得了(S)-四氫小檗堿氧化酶cDNA 全長(zhǎng)序列，其長(zhǎng)度為1127bp，含有5 '

3、-UTR，3'-UTR，ploy (A)+結(jié)構(gòu)以及一個(gè)699bp的開放閱讀框架，編碼232個(gè)氨基酸殘基,預(yù)測(cè)分子量為25.20kDa。
　　 將該基因注冊(cè)到GenBank,編號(hào)為HQ393909。RT-PCR分析表示(S)-THBO在巖黃連植株的根、莖、葉、花中都有表達(dá)，在根中表達(dá)量最高。誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)表明(S)-THBO 具有明顯的防御作用。
　　 將(S)-四氫小檗堿氧化酶構(gòu)建表達(dá)載體并在大腸桿菌中表達(dá)，并對(duì)表達(dá)(S)-四

4、氫小檗堿氧化酶的大腸桿菌對(duì)底物進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)化。表達(dá)(S)-四氫小檗堿氧化酶的大腸桿菌可以體內(nèi)轉(zhuǎn)化(S)-四氫小檗堿氧化成小檗堿，但對(duì)底物有一定的選擇性，不能將內(nèi)消旋四氫小檗堿轉(zhuǎn)化完全。
　　 巖黃連中(S)-去甲烏藥堿合成酶的克隆(S)-去甲烏藥堿合成酶是原小檗堿生物合成途徑中的第一個(gè)酶，它可以將多巴胺(Dopamine)和(4-羥苯乙酮4-hydroxyphenylhydroxyphenylacetaldehyde，(4-HPA

5、A)）催化成(S)-去甲烏藥堿（(S)-Norcoclaurine)。對(duì)巖黃連的總RNA 進(jìn)行PT-PCR 得到一段(S)-去甲烏藥堿合成酶的核心片段。通過(guò)RACE 獲得了(S)-去甲烏藥堿合成酶cDNA 全長(zhǎng)序列，其長(zhǎng)度為1003bp，含有5'-UTR, 3'-UTR,ploy (A)+結(jié)構(gòu)以及一個(gè)621bp的開放閱讀框架，編碼207個(gè)氨基酸殘基。將該基因注冊(cè)到GenBank，編號(hào)為JF488074。
　　 巖黃連中氫化小檗堿