GRIM-19在HCC中的表達(dá)及對(duì)HCC細(xì)胞遷移能力的影響.pdf

1、目的:肝細(xì)胞肝癌（HepatocellularcarcinomaHCC）是肝臟最常見的原發(fā)性腫瘤，是全球六大惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率顯著增長(zhǎng)。因此加強(qiáng)對(duì)HCC的基礎(chǔ)研究顯得極為重要。以往研究發(fā)現(xiàn)維甲酸/干擾素聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因(geneassociatedwithretinoid-interferon-inducedmortality19，GRIM—19)是一種腫瘤抑制基因，在多種惡性腫瘤中的表達(dá)水平較低，并且其蛋白表

2、達(dá)與細(xì)胞凋亡和細(xì)胞生長(zhǎng)抑制有密切的聯(lián)系。本次實(shí)驗(yàn)我們主要研究的目的是通過檢測(cè)GRIM-19mRNA在肝細(xì)胞肝癌的表達(dá)，分析其與臨床病理分期的聯(lián)系，并進(jìn)一步通過構(gòu)建GRIM-19kd和scr的細(xì)胞株HL-7701和Huh-7研究GRIM-19對(duì)HCC細(xì)胞遷移能力的影響。
　　 方法:
　　 1.應(yīng)用實(shí)時(shí)定量聚合酶連反應(yīng)技術(shù)研究GRIM-19mRNA在83例肝細(xì)胞肝癌及其癌旁肝組織和8例正常組織的表達(dá)情況，并分析其與臨床病理

3、的聯(lián)系;
　　 2.設(shè)計(jì)GRIM-19的敲除和對(duì)照序列，通過Trans1-T1PhageResistant化學(xué)感受態(tài)細(xì)菌，LA固體培養(yǎng)基篩選挑選陽性重組子。挑選好的陽性重組子通過LA液體培養(yǎng)基獲得大量包含GRIM-19質(zhì)粒的細(xì)菌，通過質(zhì)粒小提試劑盒獲得GRIM-19kd和scr的質(zhì)粒。
　　 3.培養(yǎng)低侵襲力細(xì)胞株HL-7701、MHCC97-L和高侵襲力細(xì)胞株MHCC97-H、Huh-7，并通過WesternBlot檢

4、測(cè)GRIM-19蛋白在上述細(xì)胞株的表達(dá)。通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)將GRIM-19kd和scr質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HL-7701和Huh-7，用G-418進(jìn)行篩選，從而構(gòu)建GRIM-19kd和scr細(xì)胞株并用WesternBlot檢測(cè)是否構(gòu)建成功。
　　 4.通過Transwell小室檢測(cè)HL-7701kd和scr、Huh-7kd和scr遷移能力，并用蘇木精染色方法檢測(cè)細(xì)胞數(shù)目，從而了解GRIM-19對(duì)HCC細(xì)胞遷移能力的影響。
　　 結(jié)果

5、:
　　 (1)實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)結(jié)果示:肝細(xì)胞肝癌癌組織中GRIM-19mRNA表達(dá)低于與其相對(duì)癌旁肝組織中表達(dá)的共有52例，其陽性表達(dá)率為62.65％，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。肝細(xì)胞肝癌癌組織中GRIM-19mRNA表達(dá)同正常肝組織相比，肝細(xì)胞肝癌的GRIM-19mRNA平均表達(dá)水平為，明顯低于GRIM-19mRNA在正常肝組織中的表達(dá)，差異有明顯性(P＜0.005)。
　　 (2)GRIM-1

6、9mRNA的表達(dá)與肝癌臨床病理相關(guān)性研究顯示:GRIM-19mRNA與肝細(xì)胞肝癌臨床TMN分期(P=0.011)、包膜浸潤(rùn)（P=0.047）、微血管入侵（P=0.030）密切相關(guān)。從而提示GRIM-19的同HCC的細(xì)胞遷移存一定在的聯(lián)系。
　　 (3)WestemBlot結(jié)果顯示正常肝細(xì)胞株HL-7701，肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞株MHCC97-L、MHCC-97H和Huh-7均表達(dá)GRIM-19蛋白，且低侵襲力HL-7701和MHCC9

7、7-L中GRIM-19蛋白的表達(dá)高于MHCC97-H和Huh-7。
　　 (4)WesternBlot結(jié)果顯示HL-7701kd細(xì)胞中GRIM-19蛋白的表達(dá)低于scr;Huh-7kd細(xì)胞中GRIM-19蛋白的表達(dá)低于scr，從而顯示GRIM-19的敲除細(xì)胞株構(gòu)建成功。
　　 (5)Transwell小室結(jié)果顯示同scr相比，HL-7701kd細(xì)胞數(shù)增加了，而Huh-7kd的細(xì)胞數(shù)增加了，差異有明顯差異(P＜0.05)。

8、
　　 結(jié)論:
　　 1.GRIM-19mRNA在肝細(xì)胞肝癌組織的表達(dá)明顯低于相對(duì)應(yīng)得癌旁肝組織和正常組織，說明GRIM-19mRNA在肝細(xì)胞肝癌中表達(dá)水平下調(diào)，并且GRIM-19mRNA低表達(dá)同肝細(xì)胞肝癌的臨床TMN分期、包膜浸潤(rùn)和微血管入侵有密切的相關(guān)性。
　　 2.GRIM-19與HCC細(xì)胞的遷移能力密切相關(guān)，其低表達(dá)促進(jìn)了HCC細(xì)胞得遷移能力，從而可能導(dǎo)致腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散。
　　 3.GRIM