GRIM-19在子宮頸癌中的表達(dá)情況及電離輻射對其調(diào)控作用.pdf

1、研究背景:
　　子宮頸癌在世界范圍內(nèi)是女性高發(fā)惡性腫瘤，在癌癥死亡的疾病構(gòu)成比中占據(jù)重要位置。在過去40年中，子宮頸癌的發(fā)病率及病死率卻發(fā)生了顯著下降，這一下降趨勢在發(fā)達(dá)國家尤其明顯。究其原因，主要是因為女性采用定期巴氏涂片篩查，從而檢出了很多癌前病變，早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療帶來的結(jié)果。
　　高危HPV（如HPV-16和HPV-18亞型）的慢性、持續(xù)性感染是子宮頸癌變發(fā)生的主要原因。盡管高危HPV分泌的的癌基因E6、E7在宮

2、頸細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中起到了關(guān)鍵作用，然而更多的研究表明，僅有HPV感染不足以導(dǎo)致細(xì)胞惡變。在癌癥的發(fā)生發(fā)展機制中，多種癌基因或者抑癌基因的異常表達(dá)幾乎同樣重要。
　　子宮頸的癌前病變在組織病理學(xué)上被定義為上皮內(nèi)瘤變(CIN，cervicalintra-epithelial neoplasia)，依次分級為CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ。后兩者通常又歸類為高級別上皮內(nèi)瘤變。臨床上如果不給于恰當(dāng)治療則傾向于發(fā)展為癌。然而，正常子宮頸鱗狀

3、上皮細(xì)胞是如何演變?yōu)樯掀?nèi)瘤變并繼而發(fā)展為浸潤性癌的？確切的分子生物學(xué)機制尚未完全闡明。
　　已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤生長過程中存在轉(zhuǎn)錄因子和凋亡相關(guān)基因表達(dá)的突變、抑制或缺失等機制。近期的研究結(jié)果報道，病毒和其他細(xì)胞因子能夠結(jié)合GRIM-19，進(jìn)而阻止了細(xì)胞死亡程序的啟動。GRIM-19與細(xì)胞的凋亡、生長抑制、遷移、侵襲性及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)等密切相關(guān)。在前列腺癌、原發(fā)性腎癌、口腔鱗癌、頭頸腫瘤，肝癌和結(jié)直腸癌等常見惡性腫瘤中

4、已經(jīng)發(fā)現(xiàn)存在GRIM-19表達(dá)的缺失。在大多數(shù)癌癥中，GRIM-19的mRNA幾乎不存在突變。我們已經(jīng)在前期研究工作中報道了GRIM-19通過以下三條途徑抑制宮頸癌的生長:①下調(diào)STAT3誘導(dǎo)的基因表達(dá);②拮抗E6/E6AP復(fù)合物形成誘導(dǎo)p53聚集;③誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞的E6AP的自動泛素化。本研究中，我們旨在探討宮頸組織和脫落細(xì)胞中GRIM-19的表達(dá)情況，試圖闡明GRIM-19在腫瘤發(fā)生過程中是否存在下降？同時分析宮頸癌細(xì)胞在接受電離輻

5、射后，GRIM-19和其調(diào)節(jié)蛋白p53的變化。
　　本研究分為兩部分:
　　第一部分:沉默GRIM-19表達(dá)在體內(nèi)、外實驗中是否促進(jìn)子宮頸癌的生長;電離輻射如何改變了癌細(xì)胞中GRIM-19和P53的表達(dá)。
　　第二部分:GRIM-19表達(dá)減少與子宮頸病變脫落細(xì)胞、上皮內(nèi)瘤變及癌變的相關(guān)性，及其與高危HPV感染的相關(guān)性。
　　第一部分:GRIN-19在子宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)及其與電離輻射的關(guān)系
　　目的:

6、>　　1.探討GRIM-19在子宮頸癌組織中的表達(dá)水平;
　　2.體內(nèi)、外實驗探討沉默GRIM-19的表達(dá)對腫瘤細(xì)胞生長的影響及機制;
　　3.探討子宮頸癌細(xì)胞電離輻射后的GRIM-19表達(dá)水平變化。
　　方法:
　　采用Hela、SiHa（人子宮頸癌細(xì)胞株）、HaCaT（人類正常角化細(xì)胞株）以及臨床組織標(biāo)本分析GRIM-19的表達(dá)情況。臨床標(biāo)本來自安徽省立醫(yī)院2010年2月～2013年7月期間30例子宮頸癌患者

7、活檢組織標(biāo)本，所有患者均無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移;根據(jù)FIG02014分期，ⅠB期標(biāo)本10例，ⅡA期5例，ⅡB期5例，Ⅲ期10例，其中鱗狀細(xì)胞癌20例，腺癌10例。另外20例子宮體肌瘤或?qū)m頸管肌瘤患者在接受子宮肌瘤手術(shù)中，獲得了正常子宮頸組織標(biāo)本用于對照試驗。另外選取HeLa，SiHa細(xì)胞株在電離輻射300cGy前后，進(jìn)展期子宮頸癌在放射治療(常規(guī)外照射40Gy)前后共20份子宮頸脫落細(xì)胞涂片用于研究。所有的Pap檢驗搜集于PreservCyte溶液

8、，ThinPrep法(Hologic，Marlborough，MA)。所有臨床病例均經(jīng)過活檢病理明確診斷，液基細(xì)胞學(xué)涂片由至少兩位有資質(zhì)的細(xì)胞病理學(xué)家閱片并診斷。HeLa細(xì)胞（用GRIM-19 siRNA或?qū)φ战MsiRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染）移植到6周齡的去胸腺雌性裸鼠背部皮膚下（每組有8只）用來觀察腫瘤生長情況。以上標(biāo)本進(jìn)行如下研究:①免疫組化方法和western blot分析GRIM-19在子宮頸癌細(xì)胞株及臨床組織中的表達(dá)水平;②細(xì)胞增殖實驗

9、及裸鼠成瘤實驗探討沉默GRIM-19后，腫瘤細(xì)胞的生長情況及機制;③宮頸癌細(xì)胞株電離輻射前后、以及人體子宮頸癌細(xì)胞放射治療前后的脫落細(xì)胞中GRIM-19表達(dá)水平變化。
　　結(jié)果:
　　1.GRIM-19在正常子宮頸組織中的表達(dá):近年研究中認(rèn)為GRIM-19是一類的腫瘤抑制因子，我們首先在子宮頸癌細(xì)胞中檢測了GRIM-19的表達(dá)情況。30份石蠟包埋的子宮頸癌標(biāo)本和20份正常宮頸組織標(biāo)本采用GRIM-19特異性的單抗隆抗體標(biāo)記，

10、進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析顯示:GRIM-19在正常宮頸鱗狀上皮和腺上皮中高表達(dá)，但是在鱗狀細(xì)胞癌和腺癌中表達(dá)顯著減少(如圖1 A)。免疫組化定量結(jié)果示GRIM-19蛋白表達(dá)水平在宮頸鱗癌及腺癌組織中明顯降低(P＜0.05)（圖1B）。Western blotting結(jié)果顯示宮頸癌組織中GRIM-19表達(dá)蛋白水平顯著下調(diào)（如圖1C）。
　　2.GRIM-19表達(dá)減少促進(jìn)Hela細(xì)胞株增殖:為了檢測GRIM-19與細(xì)胞生長的生物學(xué)相關(guān)性，

11、我們首先檢測了GRIM-19在子宮頸細(xì)胞株中的表達(dá)水平。與人類正常角化細(xì)胞系HaCaT相比較，宮頸癌細(xì)胞系Hela和SiHa中GRIM-19表達(dá)明顯降低。采用siRNA抑制GRIM-19表達(dá)之后，與對照組相比較，在MTT實驗中HeLa/G19 siRNA組細(xì)胞的增殖速度在第4天和第5天明顯加快(p＜0.05)（圖2）。
　　3.GRIM-19沉默后體內(nèi)成瘤情況
　　體內(nèi)實驗顯示GRIM-19表達(dá)減少促進(jìn)了腫瘤生長:為了評估G

12、RIM-19在動物實驗?zāi)[瘤生長中的作用，分別使用1×107HeLa/pCon和HeLa/G19 siRNA細(xì)胞種植到到裸鼠背部皮下組織（每組8只），監(jiān)測腫瘤生長情況，并于42天處死(圖3)。結(jié)果顯示:第42天HeLa/G19 siRNA組腫瘤體積均值為9.8175±0.7198mm3;而對照組為7.12678±0.5689mm3，兩組差異顯著(p＜0.05)。剝除腫瘤通過RT-PCR和western blotting實驗方法進(jìn)一步驗證了

13、GRIM-19的抑制情況，同時我們發(fā)現(xiàn)，HeLa/G19 siRNA組中p53的表達(dá)降低，而STAT3表達(dá)水平顯著升高。為了進(jìn)一步探討GRIM-19與腫瘤生長之間的關(guān)系，我們采用免疫組織化學(xué)方法檢測增殖相關(guān)抗原Ki-67的表達(dá)情況。實驗結(jié)果顯示:與對照組相比較，在沉默GRIM-19基因的實驗組腫瘤組織中Ki-67的表達(dá)顯著升高(圖3 E～F)。
　　4.宮頸癌細(xì)胞電離輻射后GRIM-19表達(dá)顯著升高
　　我們還檢測了HeLa

14、和SiHa細(xì)胞株在電離輻射后GRIM-19的表達(dá)情況。將HeLa與SiHa細(xì)胞株在1.5分鐘內(nèi)接受300cGy高能X射線（6MV-X），24小時后檢測p53和GRIM-19水平發(fā)現(xiàn)表達(dá)上調(diào)。人進(jìn)展期子宮頸外照射40Gy（常規(guī)分割）前后選取脫落細(xì)胞，取材前使用0.05％高錳酸鉀溶液充分沖洗陰道，然后檢測p53和GRIM-19的表達(dá)情況。結(jié)果顯示:進(jìn)展期鱗狀細(xì)胞癌放射治療后子宮頸表面脫落細(xì)胞的p53和GRIM-19表達(dá)明顯升高（如圖4）。<

15、br>　　結(jié)論:
　　GRIM-19基因在正常宮頸上皮細(xì)胞中高表達(dá)，在宮頸癌細(xì)胞中低表達(dá);GRIM-19在宮頸癌細(xì)胞中表達(dá)降低通過下調(diào)p53蛋白和STAT3表達(dá)升高而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長和增殖;電離輻射殺傷癌細(xì)胞機制之一可能是通過上調(diào)GRIM-19表達(dá)致p53蛋白積聚而起到抗腫瘤的作用。
　　第二部分:GRIM-19在子宮頸癌前病變及癌細(xì)胞中的表達(dá)水平及其與高危HPV感染的相關(guān)性
　　目的:
　　1.研究GRIM-1

16、9在人子宮頸脫落細(xì)胞中的表達(dá)特點及水平;
　　2.研究GRIM-19的表達(dá)與高危型HPV感染的相關(guān)性;
　　3.研究GRIM-19在癌前病變組織中的表達(dá)水平。
　　方法:
　　選取安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院婦科細(xì)胞學(xué)實驗室的液基細(xì)胞學(xué)標(biāo)本，包括正常鱗狀上皮細(xì)胞涂片40張，ASCUS（不典型鱗狀上皮細(xì)胞）涂片40張，LSIL（低度鱗狀上皮內(nèi)瘤變）涂片40張，HSIL（高度鱗狀上皮內(nèi)瘤變）涂片40張以及確診SCC（子宮

17、頸鱗癌）患者的脫落癌細(xì)胞標(biāo)本20張。排除標(biāo)準(zhǔn)為:年齡＜21歲，既往接受過子宮切除手術(shù)，無足夠殘留液體提取細(xì)胞蛋白質(zhì)。所有的Pap檢驗均使用PreservCyte溶液采集、并用ThinPrep法(Hologic，Marlborough，MA，USA)處理。陰道鏡下直取活檢標(biāo)本包括:20例正常宮頸組織、35例CINⅠ、30例CINⅡ、30例CINⅢ和20例鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本，經(jīng)10％福爾馬林緩沖液固定后蘇木精伊紅常規(guī)方法染色。所有的巴氏涂片與組

18、織學(xué)活檢切片經(jīng)由至少一位有經(jīng)驗的婦科腫瘤病理學(xué)家兼細(xì)胞病理學(xué)家復(fù)閱。子宮頸脫落細(xì)胞的液基細(xì)胞學(xué)診斷報告采用Bethesda系統(tǒng)，活檢標(biāo)本的組織病理學(xué)報告使用CIN（上皮內(nèi)瘤變）方法。進(jìn)行以下研究:①通過免疫組化分析子宮頸脫落細(xì)胞中GRIM-19表達(dá)的特點及水平;②通過Westem Blotting分析子宮頸脫落細(xì)胞及宮頸癌細(xì)胞株中GRIM-19表達(dá)的水平;③通過HC-2方法檢測HPV感染情況，并分析子宮頸癌前病變中GRIM-19與高危H

19、PV感染的關(guān)系;④通過.免疫組化進(jìn)一步驗證GRIM-19在不同級別的子宮頸上皮內(nèi)瘤變和鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)的水平及相關(guān)性。統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS軟件。
　　結(jié)果:
　　1.子宮頸脫落細(xì)胞中GRIM-19表達(dá)的免疫組化分析
　　子宮頸鱗狀上皮結(jié)構(gòu)總體上分為三層:表皮層（角化細(xì)胞），中間層，基底層。臨床上細(xì)胞涂片檢驗采集到的子宮頸脫落細(xì)胞主要來自表皮層和中間層。我們首先分析了GRIM-19在脫落細(xì)胞中的表達(dá)，GRIM-19在子

20、宮頸鱗狀上皮的中層細(xì)胞中表達(dá)率為94.2±2.8％(188.4±5.5/200)（如圖1a和a'）;而在表層細(xì)胞中的表達(dá)率是0±0％(0±0.00/200)（如圖1b和b'）。因此GRIM-19主要表達(dá)在中層細(xì)胞中，而在表層細(xì)胞（角化細(xì)胞）中不表達(dá)。
　　我們在相應(yīng)的巴氏涂片中分別記數(shù)了ASCUS細(xì)胞、LSIL細(xì)胞、HSIL細(xì)胞和SCC細(xì)胞各200個，以檢測GRIM-19的表達(dá)情況。GRIM-19在ASCUS、LSIL、HSIL、

21、SCC細(xì)胞中表達(dá)依次減低（如圖2），其陰性表達(dá)率分別為:ASCUS16.5％，LSIL32.0％，HSIL60.5％，SCC97.5％（表1）。這一結(jié)果提示在子宮頸癌惡性轉(zhuǎn)化的過程中GRIM-19的表達(dá)逐漸下調(diào)。GRIM-19的表達(dá)與細(xì)胞學(xué)診斷結(jié)果高度相關(guān)(p＜0.001)。
　　2.子宮頸脫落細(xì)胞GRIM-19表達(dá)的Western Blotting分析
　　我們采用western blotting進(jìn)一步研究了GRIM-19

22、的表達(dá)水平。因為在子宮頸表皮層脫落細(xì)胞中GRIM-19不表達(dá)，所以我們在每一張涂片上計算出細(xì)胞表達(dá)百分比。在得出GRIM-19/GAPDH表達(dá)的蛋白含量數(shù)值之后，子宮頸中層細(xì)胞的GRIM-19表達(dá)的相對含量采用公式:中層脫落細(xì)胞/（中層脫落細(xì)胞+表層脫落細(xì)胞）×100％。在正常宮頸中層脫落細(xì)胞中的GRIM-19/GAPDH實驗組的比值被標(biāo)準(zhǔn)化定義為1。實驗發(fā)現(xiàn)，與正常子宮頸鱗狀上皮的中層細(xì)胞相比較，GRIM-19表達(dá)在LSIL(P＜0.

23、05)、HSIL(P＜0.05)、SCCs(P＜0.001)細(xì)胞中表達(dá)顯著降低(如圖3A-C)。
　　3.子宮頸癌前病變中GRIM-19表達(dá)與高危HPV感染的關(guān)系
　　由于子宮頸鱗狀細(xì)胞癌與高危HPV持續(xù)感染密切相關(guān)，我們進(jìn)一步探討了子宮頸脫落細(xì)胞中高危HPV感染和GRIM-19表達(dá)之間的關(guān)系。結(jié)果顯示GRIM-19的表達(dá)與高危HPV感染負(fù)相關(guān)（X2=57.583，r=-0.268，P＜0.001）（見表2）。
　　4

24、.GRIM-19在不同級別的子宮頸上皮內(nèi)瘤變和鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)的免疫組化分析
　　為了進(jìn)一步驗證GRIM-19在宮頸脫落細(xì)胞中的結(jié)果，我們通過陰道鏡直取活檢組織標(biāo)本，在不同級別的上皮內(nèi)瘤變與浸潤性鱗癌組織中再次分析了GRIM-19的表達(dá)情況（如圖4A-E）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GRIM-19在正常子宮頸上皮的中層、基底層細(xì)胞的胞漿中表達(dá)幾乎為100％(20/20)。免疫組織化學(xué)分析的研究結(jié)果顯示GRIM-19陰性表達(dá)率為:CINⅠ20.0％

25、(7/35)，CINⅡ23.3％(7/30)，CINⅢ56.7％(17/30)，SCC95.0％(19/20)。免疫組化染色評分結(jié)果顯示，與正常宮頸組織相比，GRIM-19的表達(dá)水平在CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、SCC中依次下降，且CINⅡ、CINⅢ、SCC中的表達(dá)顯著下降統(tǒng)計學(xué)上有差異，分別為P＜0.05、P＜0.05、P＜0.001(如圖4F)。GRIM-19的表達(dá)與病理組織學(xué)診斷結(jié)果高度相關(guān)(p＜0.001)（表3）。
　

26、　結(jié)論:
　　1.GRIM-19主要表達(dá)在正常宮頸上皮的中層細(xì)胞，而在表層細(xì)胞（角化細(xì)胞）中不表達(dá)。
　　2.GRIM-19的表達(dá)與細(xì)胞學(xué)診斷結(jié)果高度相關(guān):其表達(dá)水平在LSIL、HSIL、SCC細(xì)胞中依次降低。
　　3.GRIM-19的表達(dá)與病理組織學(xué)診斷結(jié)果高度相關(guān):其表達(dá)水平在CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、SCC中依次逐漸下降，且CINⅡ、CINⅢ、SCC中的表達(dá)顯著下降。
　　4.GRIM-19的表達(dá)與高危