環(huán)孢素對(duì)正常人和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人記憶性Th17細(xì)胞的抑制作用及其機(jī)制.pdf

1、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種慢性全身免疫性疾病，以炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)關(guān)節(jié)滑膜、滑膜增生和軟骨組織破壞為特征。臨床表現(xiàn)為受累關(guān)節(jié)疼痛、腫脹和功能下降。全世界約有1％的人口患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。而在我國(guó)，RA病人約有400萬人。RA的病因目前尚不清楚，有學(xué)者提出輔助性T細(xì)胞亞群(Th)及其細(xì)胞因子在RA的發(fā)病機(jī)制中有非常重要的作用。以往的研究認(rèn)為，RA是Th1細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病，主要由IFN-γ、TNF-α和IL-6等細(xì)胞因子參與疾病的發(fā)生與

2、發(fā)展。但近年來，人們發(fā)現(xiàn)一群新的CD4+T細(xì)胞亞群——Th17細(xì)胞在其發(fā)病過程中扮演著及其重要的角色。Th17細(xì)胞主要分泌IL-17。IL-17是促炎因子，可促進(jìn)單核細(xì)胞產(chǎn)生IL-1和TNF-α，還可在局部關(guān)節(jié)刺激滑膜細(xì)胞分泌炎癥相關(guān)因子IL-6、IL-8、GM-CSF和PGE2。研究發(fā)現(xiàn)，RA病人的關(guān)節(jié)滑液中含有較高水平的IL-17和富集大量的Th17細(xì)胞。另外，在RA的動(dòng)物模型中，阻斷IL-17分泌后，炎癥反應(yīng)明顯降低，骨組織破壞也

3、顯著改善。這都提示IL-17和Th17細(xì)胞可能是將來治療RA的重要靶點(diǎn)。 環(huán)孢素A(cyclosporin A，CsA)是一種傳統(tǒng)的免疫抑制劑。由Borel于1972年首次發(fā)現(xiàn)，是從真菌培養(yǎng)液中分離獲得的中性環(huán)狀十一肽化合物。CsA最初應(yīng)用于器官移植，如今被廣泛應(yīng)用于治療各種自身免疫性疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、銀屑病、IgA腎病、糖尿病等。目前，CsA對(duì)細(xì)胞免疫作用機(jī)制還不是十分明確。雖然有研究報(bào)道其可通過影響T細(xì)胞內(nèi)鈣依

4、賴的信號(hào)途徑，從而抑制細(xì)胞因子的合成與分泌，但仍需進(jìn)一步的探索。近年，有人發(fā)現(xiàn)小劑量的CsA可抑制佛波酯和離子霉素刺激RA病人關(guān)節(jié)滑液中IL-17的分泌；也有人發(fā)現(xiàn)，CsA可抑制IL-15刺激正常人和RA病人單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)產(chǎn)生IL-17。因此，本課題從細(xì)胞免疫角度，研究CsA對(duì)正常志愿者和RA病人PBMCs和CD4+T細(xì)胞亞群分泌IL-17的影響，并進(jìn)一步揭示CsA的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用CsA治療RA提供了更充分的理論依據(jù)。

5、 1、目的 以體外淋巴細(xì)胞培養(yǎng)為模型，研究臨床常用免疫抑制藥物環(huán)孢素A對(duì)Th17淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-17的抑制作用，并探討其作用機(jī)制，為臨床上應(yīng)用環(huán)孢素A進(jìn)一步提供理論依據(jù)。 2、方法 2.1抽取正常人(32人)和RA病人(6人)外周靜脈血。用密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)。 2.2分離正常人的PBMCs，加入抗C

6、D4免疫微磁珠抗體孵育，將LS柱放置于磁珠分離器上磁性分離結(jié)合抗CD4微磁珠抗體的CD4+T細(xì)胞。取2×105純化的細(xì)胞，加入CD4-PE抗體孵育，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+T細(xì)胞的純化率，CD4+T細(xì)胞陽性率超過95％，用于細(xì)胞培養(yǎng)。 2.3用抗CD3抗體和抗CD28抗體刺激分離的PBMCs和CD4+T細(xì)胞，利用半定量RT-PCR觀察細(xì)胞因子IL-17 mRNA的表達(dá)，利用ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中IL-17和IFN-γ產(chǎn)生的量

7、，利用流式細(xì)胞術(shù)觀察產(chǎn)生IL-17和IFN-γ陽性細(xì)胞的表型和表達(dá)情況。同時(shí)，利用流式細(xì)胞術(shù)觀察代表細(xì)胞活化的細(xì)胞表面標(biāo)志物CD69和CD25及代表細(xì)胞增殖的BrdU摻入和CFSE標(biāo)記的變化。 3、結(jié)果 3.1在抗CD3抗體和抗CD28抗體刺激條件下，環(huán)孢素A呈劑量依賴性抑制正常人PBMCs和CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生IL-17，并抑制IL-17 mRNA的轉(zhuǎn)錄。環(huán)孢素A的作用強(qiáng)度與時(shí)間呈正相關(guān)。 3.2在抗CD3抗體和

8、抗CD28抗體刺激條件下，環(huán)孢素A可降低正常人記憶性IL-17+T細(xì)胞的陽性率，抑制BrdU的摻入和減少CFSE標(biāo)記的細(xì)胞分裂次數(shù)；環(huán)孢素A可抑制T細(xì)胞活化分子CD69、CD25的平均熒光密度。 3.3RA病人PBMCs經(jīng)抗CD3抗體和抗CD28抗體刺激后，IL-17的產(chǎn)生明顯高于正常人PBMCs(P<0.05)。環(huán)孢素A可抑制RA病人IL-17的產(chǎn)生和IL-17+T細(xì)胞的表達(dá)。 結(jié)論： CsA抑制正常人和RA病