Prohibitin在人永生化表皮HaCaT細(xì)胞凋亡過程中的表達(dá)及其調(diào)控作用研究.pdf

1、本論文以姜黃素誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞凋亡為基礎(chǔ),運(yùn)用亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)HaCaT細(xì)胞凋亡前后核基質(zhì)蛋白組成變化進(jìn)行系統(tǒng)分析,發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞凋亡過程中的特異核基質(zhì)蛋白Prohibitin(PHB)表達(dá)下調(diào),并以此為目標(biāo)蛋白,對(duì)其在HaCaT細(xì)胞中的表達(dá)與定位及其與相關(guān)癌基因、抑癌基因產(chǎn)物的共定位及相互作用關(guān)系進(jìn)行了研究。探索PHB在HaCaT細(xì)胞凋亡過程中的調(diào)控作用,以期能夠揭示PHB在人永生化表皮HaCaT凋亡過程中的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò),從而找出

2、深入探索表皮細(xì)胞凋亡的研究方向。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,經(jīng)7.5mg/L姜黃素誘導(dǎo)處理之后,人永生化表皮HaCaT細(xì)胞的增殖活動(dòng)明顯受到抑制,細(xì)胞體積縮小、細(xì)胞核固縮、核內(nèi)染色質(zhì)凝聚;瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)細(xì)胞凋亡典型的DNA“梯狀”條帶;而且與細(xì)胞凋亡相關(guān)基因p53、rb、c-myc、bcl-2等表達(dá)下調(diào),抑癌基因:fas、bax等表達(dá)上調(diào)。HaCaT細(xì)胞凋亡前后的核基質(zhì)蛋白的雙向電泳和質(zhì)譜分析共鑒定了21種表達(dá)差異核基質(zhì)蛋白,其中

3、PHB表達(dá)下調(diào)。Western blotting實(shí)驗(yàn)證明,HaCaT細(xì)胞凋亡過程中PHB在核基質(zhì)蛋白中表達(dá)下調(diào)而全細(xì)胞蛋白水平表達(dá)上調(diào)。激光共聚焦顯微鏡觀察顯示PHB在HaCaT細(xì)胞中分別與Fas、c-Myc、P53、Rb、Bax和Bcl-2等蛋白具有或強(qiáng)或弱的共定位關(guān)系,凋亡處理后其共定位區(qū)域發(fā)生了相應(yīng)變化。本研究成功構(gòu)建PHB原核表達(dá)載體pGEX-4T-2-phb,并在重組蛋白可溶性誘導(dǎo)表達(dá)及純化基礎(chǔ)上,利用GST pull-dow

4、n實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)在HaCaT細(xì)胞中,PHB分別與c-Myc、P53和Bax有直接相互作用關(guān)系。真核表達(dá)載體pEGFP-Cl-phb的構(gòu)建及真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果,證明了PHB在HaCaT細(xì)胞凋亡過程中的定位及其轉(zhuǎn)位變化。
　　 研究結(jié)果表明,7.5mg/L姜黃素能顯著誘導(dǎo)人永生化表皮HaCaT細(xì)胞的凋亡,并能通過干預(yù)人永生化表皮HaCaT細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的活性,改變多種與基因表達(dá)調(diào)控和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的重要核基質(zhì)蛋白的表達(dá),其中PHB

5、為誘導(dǎo)多種細(xì)胞凋亡后出現(xiàn)的共同差異核基質(zhì)蛋白。本研究發(fā)現(xiàn)PHB與凋亡相關(guān)基因bax、bcl-2、fas、p53、c-myc和rb的蛋白產(chǎn)物均存在不同程度的共定位關(guān)系并在HaCaT細(xì)胞凋亡過程中分別出現(xiàn)定位和轉(zhuǎn)位變化的現(xiàn)象,而且GST pull-down實(shí)驗(yàn)證明了PHB與c-Myc、P53和Bax存在直接的相互作用關(guān)系。由此證實(shí)姜黃素誘導(dǎo)人永生化表皮HaCaT細(xì)胞凋亡與核基質(zhì)的表達(dá)變化是密不可分的,特異核基質(zhì)蛋白PHB通過與其具有相互作用