喹烯酮臨床前毒理學(xué)研究.pdf

1、本文為評價喹烯酮的安全性，進行了系統(tǒng)的臨床前毒性試驗。測定喹烯酮的急性毒性，致突變性，亞慢性毒性，喂養(yǎng)致畸毒性和繁殖毒性，計算ADI(每日容許攝入量)和其在動物性食品中的最高殘留限量。為喹烯酮的開發(fā)應(yīng)用提供毒理學(xué)安全性評價依據(jù)。 1.急性毒性試驗。 Wistar大鼠和昆明小鼠各60只，雌雄各半，喹烯酮用0.5％羧甲基纖維素鈉(CMC)助溶制成混懸液，同時設(shè)同類藥物喹乙醇、卡巴氧和痢菌凈作為對照，采用一次性灌胃染毒，觀察1

2、4d內(nèi)的中毒反應(yīng)，用寇氏法計算半數(shù)致死量和95％的可信限。結(jié)果表明，喹烯酮對Wistar大鼠和昆明小鼠的經(jīng)口LD<,50>分別為8687.31和15848.93mg/kg b.W.；喹乙醇、卡巴氧和痢菌凈對Wistar大鼠經(jīng)口LD<,50>分別為1877.63、878.01和562.34 mg/kg b.W.對昆明小鼠經(jīng)口LD<,50>分別為3677.56、2815.51和694.44 mg/kg b.W.。按照急性毒性分級標準喹烯酮為

3、實際無毒物質(zhì)，喹乙醇、卡巴氧和痢菌凈都為低毒物質(zhì)。 2.遺傳毒性研究。 鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變(Ames)試驗試驗菌株為TA<,97>，TA<,98>，TA<,100>，TA<,102>，TA<,1535>，TA<,1537>。試驗劑量為1.0，2.6，6.9，18.2，50.0μg/皿，用已知的陽性物作陽性對照，同時設(shè)溶劑對照(二甲亞砜(DMSO))和空白對照(蒸餾水)，加和不加S9混合液的對照。每個處理作3個平行平皿

4、，采用平皿摻入法，計數(shù)各皿回變菌落數(shù)，結(jié)果評價為計算各處理平均每皿誘發(fā)回變菌落數(shù)與相應(yīng)的空白對照組的平均每皿自發(fā)回變菌落數(shù)的比值(MR)，如MR大于2為陽性，小于2為陰性。 試驗結(jié)果表明，喹烯酮對TA<,102>和TA<,1535>加與不加S<,9>時都為陰性；TA<,97>加和不加S9在劑量≥6.9μg/皿時均為陽性；TA<,95>加和不加S<,9>在劑量為50.0μg/皿時均為陽性；TA<,100>加和不加S<,9>在劑量≥

5、18/2μg/皿時均為陽性；TAl537加S9在劑量≥6.9μg/皿時為陽性，不加S9在劑量≥18.2μg/皿時為陽性。作為對照藥物，喹賽多的結(jié)果與喹烯酮基本相似，喹乙醇、卡巴氧和痢菌凈對各菌株均為陽性結(jié)果，并呈一定的劑量.反應(yīng)關(guān)系。小鼠骨髓細胞微核試驗昆明種小鼠按體重隨機分組，每組10只，雌雄各半，試驗分組分別為溶劑對照組(0.5％CMC)，喹烯酮組(1700，3600，7200mg/kg b.w.)，陽性對照組(環(huán)磷酰胺(CP)40

6、mg/kg b.w.)，并設(shè)藥物對照喹賽多組(3600，6000，10000mg/kg b.W.)、喹乙醇組(400，700，1700mg/kg b.w.)、卡巴氧(350，700，1400mg/kgb.w.)和痢菌凈(90，175，350mg/kg b.w.)。各組經(jīng)口灌胃給藥2次，間隔24h，于末次給藥后6h采樣制片。每只小鼠計數(shù)1000個嗜多染紅細胞，計算含微核的嗜多染紅細胞(MNPCE)數(shù)和含微核的嗜多染紅細胞率，同時計數(shù)嗜多染

7、紅細胞(PCE)和正染紅細胞(NCE)的比例。 結(jié)果表明，溶劑對照組和喹烯酮、喹賽多各劑量組含微核嗜多染紅細胞率與陰性對照組比較差異不顯著(P>0.05)。陽性對照組和喹乙醇組、卡巴氧組及痢菌凈組微核率顯著增加，與陰性對照組比較差異顯著(P<0.01)。各組小鼠的.PCE/NCE均>1.0，表明各藥物對小鼠骨髓未呈明顯的細胞毒性作用，紅細胞的形成未受到抑制，不影響微核計數(shù)。陰性對照組含微核多染紅細胞率<3‰，符合一般自發(fā)率。喹烯

8、酮、喹賽多微核試驗結(jié)果為陰性，喹乙醇、卡巴氧和痢菌凈微核試驗結(jié)果為陽性。 體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗以中國倉鼠肺成纖維細胞V79株為測試系統(tǒng)，設(shè)喹烯酮組(1.25、2.5、5.0、10.0μg/mL)藥物對照喹乙醇組、卡巴氧組、痢菌凈組(劑量同喹烯酮組)和喹賽多組(0.625、1.25、2.5、5.0μg/mL)，并設(shè)溶劑對照組(DMSO)和陽性對照組。實驗分別在加或不加S<,9>混合物的條件下進行，不加S<,9>混合物在加

9、入受試物24、48h后制片；加S9混合物在加入受試物6h后換液，培養(yǎng)至24h制片。每一劑量計數(shù)200個中期分裂相細胞，計算畸變細胞率。 試驗結(jié)果表明，喹烯酮和喹賽多各劑量組在加與不加S<,9>時細胞畸變率均小于5％，為陰性。喹乙醇、卡巴氧和痢菌凈在加與不加S<,9>時細胞畸變率均大于10％，為陽性。 3.90d喂養(yǎng)試驗。 SPF級Wistar大鼠400只，按體重隨機分為5組，每組雌雄各40只。設(shè)喹烯酮試驗組，劑量

10、為50、300、1800mg/kg飼料；藥物對照喹乙醇組，劑量為300mg/kg飼料；空白對照組，飼以不添加藥物的飼料。雌雄分籠飼養(yǎng)。各組均連續(xù)飼喂14周。每周稱量動物體重和飼料，計算飼料利用率。分別于用藥后在第30d、60d、90d時每組撲殺大鼠雌雄各10只，余下大鼠給予基礎(chǔ)飼料飼喂1周后撲殺。取全血作血常規(guī)檢驗，血清作生化指標檢驗，并進行病理剖檢和病理組織學(xué)檢查，主要臟器稱重，計算臟器系數(shù)。結(jié)果表明，大鼠在90d內(nèi)，喹烯酮50mg/

11、kg和300mg/kg飼料組尿常規(guī)、血常規(guī)和生化指標與空白相比無顯著差異(p>0.05)，組織病理學(xué)檢查也未發(fā)現(xiàn)與藥物有關(guān)的異常病變。1800mg/kg喹烯酮組大鼠的平均體重極顯著低于對照組(p<0.01)。喹烯酮1800mg/kg組和300mg/kg喹乙醇組大鼠的血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性顯著低于空白組(p<0.05)，腎、肝、睪丸(帶附睪)的臟器系數(shù)顯著大于空白組(p<0.05)，尿常規(guī)、血常規(guī)和其他生化指標均沒有異常變化。組織病理學(xué)

12、觀察表明，喹烯酮1800mg/kg和喹乙醇300mg/kg飼料組部分大鼠肝臟匯管區(qū)膽管增生。喹烯酮對Wistar大鼠亞慢性毒作用的靶器官為肝臟，與喹乙醇相同。喹烯酮亞慢性最大未觀察的有害作用劑量(NOAEL)為300mg/kg飼料，相當(dāng)于30mg/kg b.W.。 4.喂養(yǎng)致畸試驗。 SPF級Wistar大鼠按體重隨機分為5組，每組雌性24只，雄性12只。設(shè)喹烯酮試驗組(50、300、1800mg/kg飼料)，藥物對照喹

13、乙醇組(300mg/kg飼料)，空白對照組。各組均連續(xù)飼喂12周后進行交配。妊娠第20d剖腹進行畸胎檢查?；z查包括測窩重、活胎數(shù)、死胎數(shù)、胎鼠體重、體長、尾長等。試驗結(jié)果表明，喹烯酮1800mg/kg組胎鼠體重、體長、尾長和窩重極顯著低于空白對照組(p<0.01)，死胎數(shù)極顯著高于空白對照組(p<0.01)。各組均未出現(xiàn)明顯的與藥物相關(guān)的外觀和內(nèi)臟畸形。空白組、喹烯酮1800mg/kg飼料組與喹乙醇300mg/kg飼料組各出現(xiàn)2例、

14、1例和1例多肋變異，但與空白組比較差異不顯著。除此之外未發(fā)現(xiàn)明顯的骨骼畸形。喹烯酮致畸試驗NOAEL為300mg/kg飼料，相當(dāng)于30mg/kg b.w.。 5.二代繁殖試驗。 SPF級Wistar大鼠按體重隨機分為5組，第一代每組雌性30只，雄性15只；第二代每組雌性24只，雄性12只。設(shè)喹烯酮試驗組(50、300、1800mg/kg飼料)，藥物對照喹乙醇組(300mg/kg飼料)，空白對照組。各組均連續(xù)飼喂10周后進

15、行交配。試驗中觀察親代及子代動物的體重、飼料利用率、胎仔平均體重等指標，取其生殖器官進行病理組織學(xué)檢查，并計算繁殖指數(shù)。結(jié)果表明，F(xiàn)<,0>代和F<,1>喹烯酮1800mg/kg組胎鼠體重和飼料利用率低于空白對照組，窩平均活崽數(shù)和第2ld平均仔重與空白對照組相比差異極顯著(p<0.01)。組織病理學(xué)檢查未見各組大鼠生殖器官受到損傷。喹烯酮對大鼠生殖發(fā)育毒性的NOAEL為300mg/kg飼料，相當(dāng)于30mg/kg b.w.。 6.

16、計算每日容許攝入量(ADI)及最高殘留限量 根據(jù)上述各試驗結(jié)果得到喹烯酮的NOAEL為30mg/kg b.w.，按照FDA的ADI和最高殘留限量公式，計算其ADI為0.03mg/kg b.w；在肌肉、肝臟、腎臟和脂肪的最高殘留限量分別為6.0、18.0、36.0和36.0mg/kg。實際給藥時動物組織中原藥及代謝物的殘留量遠遠低于最高殘留限量。所以，喹烯酮的安全性很高。 上述試驗均按照美國食品藥品管理局(FDA)2000

17、年頒布的食品安全性評價毒理學(xué)原則，參照我國農(nóng)業(yè)部(MOA)頒布的《新獸藥一般毒性試驗技術(shù)要求》和《新獸藥特殊毒性試驗技術(shù)要求》進行試驗設(shè)計，并按照衛(wèi)生部(MOH)頒布食品安全性毒理學(xué)評價程序和方法，獸藥注冊國際協(xié)調(diào)局(VICH)的新獸藥安全性評價要求進行規(guī)范和完善。在對喹烯酮的急性毒性、亞慢性毒性、致突變性、致畸性、繁殖毒性進行了系統(tǒng)評價，并與同類藥物喹乙醇進行比較。本研究結(jié)果與相關(guān)研究基本一致，喹烯酮的毒性很低，明顯弱于喹乙醇，其最高