咪喹莫特對哮喘小鼠氣道炎癥和Th2型趨化因子，STAT6表達的影響.pdf

1、支氣管哮喘是一種以嗜酸性粒細胞浸潤，氣道高反應性，間斷發(fā)作的氣流阻塞，免疫球蛋白(Ig)E升高為特征的慢性氣道炎癥。CD4+T淋巴細胞在哮喘發(fā)病中起重要作用?；诩毎蜃颖磉_譜的不同，CD4+T淋巴細胞至少分為兩型，即Th1和Th2淋巴細胞。哮喘發(fā)作時，Th2細胞因子如IL-4、IL-13和IL-5明顯增高，Th1細胞因子如IL-12、IFN-γ下降。目前認為哮喘最重要的免疫學異常在于Th1/Th2亞群數(shù)目和(或)功能失衡。糾正這種失衡

2、的免疫學反應是控制哮喘發(fā)作的一個重要研究方向。 近年來，一組小分子量的免疫調節(jié)劑咪唑喹琳胺家族問世，咪喹莫特是該家族成員之一，它能結合于天然免疫系統(tǒng)的細胞TLR7、8受體上，誘導Th1細胞因子產生，具有抗病毒和抗腫瘤的作用。咪喹莫特的同類物resiquimod與OVA共同刺激B細胞，能增加OVA-特異性IgG2α和抑制IgE的合成。以上研究表明咪喹莫特可能對以Th2免疫反應占優(yōu)勢的支氣管哮喘有治療作用。 第一部分：咪喹莫

3、特對致敏小鼠脾T淋巴細胞的調節(jié)研究 目的：觀察咪喹莫特對致敏小鼠脾臟T淋巴細胞的調節(jié)作用。方法BALB/C小鼠用卯蛋白致敏兩次后，用尼龍毛柱法分離脾臟T細胞，將細胞分為三組，分別為空白對照組，卵蛋白組和咪喹莫特組，各組細胞孵育不同的時間后，用流式細胞儀檢測各組Th1和Th2細胞的比例。結果空白對照組分化為Th1和Th2細胞比例均較低。卵蛋白組分化為Th1和Th2的細胞均增多，至24小時，Th1/Th2為0.42。咪喹莫特組孵育至

4、24小時，Th1/Th2為1.83，Th1細胞數(shù)較卵蛋白組明顯增多，Th2細胞數(shù)較卵蛋白組明顯降低。結論咪喹莫特能抑制致敏T淋巴細胞向Th2方向分化，促進致敏T淋巴細胞向Th1方向分化。 第二部分咪喹莫特對哮喘小鼠氣道炎癥和Th2趨化因子、STAT6表達的影響 目的：觀察咪喹莫特對小鼠哮喘模型氣道炎癥和肺組織Th2型趨化因子Eotaxin、MDC、TARC及趨化因子受體CCR3、CCR4，轉錄因子STAT6表達的影響。方

5、法將40只BALB/C小鼠分成4組，分別為對照組，哮喘組，咪喹莫特組，地塞米松組，每組10只。OVA霧化結束后24h，測定對乙酰膽堿的氣道反應性；小鼠眼球摘除采血收集血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法測定血清中Eotaxin、MDC和TARC水平；收集BALF進行細胞計數(shù)和分類，測定BALF中IL-4和IFN-γ；H-E染色觀察肺組織炎癥改變；用免疫組化方法檢測肺組織Eotaxin、MDC、TARC、CCR3和CCR4的表達；用逆轉錄-聚合酶鏈反

6、應半定量方法檢測肺組織IL-4、IFN-γ、Eotaxin、MDC、TARC、CCR3、CCR4、STAT1和STAT6mRNA表達水平。結果(1)咪喹莫特組小鼠氣道炎癥和氣道高反應性較哮喘組明顯減輕。(2)哮喘組小鼠BALF中細胞總數(shù)及各種炎癥細胞較正常組顯著增加，咪喹莫特治療組嗜酸性粒細胞、單核細胞比哮喘組明顯減少。(3)咪喹莫特治療組小鼠血清Eotaxin、MDC和TARC水平較哮喘組下降。(4)咪喹莫特治療組小鼠肺組織Eotax

7、in、MDC、TARC、CCR4、IL-4和STAT6蛋白和mRNA表達較哮喘組降低，比正常組表達增加。結論霧化吸入咪喹莫特可在一定程度上減輕哮喘小鼠的氣道炎癥和氣道反應性，抑制肺組織Eotaxin、MDC、TARC、CCR4、IL-4和STAT6蛋白和mRNA的過度表達。 第三部分、咪喹莫特對氣道上皮細胞A549TARC表達的影響 目的：觀察咪喹莫特對氣道上皮細胞TARC表達有無作用及這種作用是否與STAT6有關。方法

8、A549細胞分別與細胞因子和藥物共同孵育4、16、24、48和72小時。用ELISA方法測定培養(yǎng)液中TARC水平；RT-PCR方法測定A549細胞TARCmRNA表達；westerblot方法測定A549細胞STAT6和P-STAT6水平。結果IL-4和IL-13單獨刺激A549細胞，培養(yǎng)液中TARC水平低于最低檢測值，當聯(lián)合TNF-α時，隨著刺激時間的延長，TARC水平明顯升高，到72小時達到最大值。咪喹莫特能顯著抑制A549細胞TA