poly（I：C）對(duì)碘過量誘發(fā)NOD鼠自身免疫性甲狀腺炎的影響.pdf

1、目的： 膳食中攝入過量碘可能會(huì)導(dǎo)致自身免疫性甲狀腺疾病的發(fā)生，但是其發(fā)病機(jī)制至今仍未完全闡明。結(jié)合研究所發(fā)現(xiàn)的病毒感染可參與某些自身免疫性疾病發(fā)生，以及在甲狀腺細(xì)胞系FRTL-5細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)TIR3 mRNA表達(dá)并且在Hashimoto’s病人甲狀腺標(biāo)本中100％檢測(cè)到TLR3蛋白過量表達(dá)等實(shí)驗(yàn)依據(jù)，本文假設(shè)，病毒感染對(duì)高碘所致自身免疫性甲狀腺疾病的發(fā)生可能具有一定影響。利用自身免疫性疾病易感的NOD小鼠，通過高碘飲水復(fù)制淋巴細(xì)胞

2、浸潤(rùn)性甲狀腺炎動(dòng)物模型，以合成的雙鏈RNApoly(I：C)作為病毒類似物，從在體和離體兩個(gè)方面觀察其對(duì)高碘引起的甲狀腺功能改變、細(xì)胞凋亡和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)因子基因表達(dá)變化的作用，探討poly(I：C)對(duì)高碘所致自身免疫性甲狀腺炎發(fā)病的影響。 方法： 在體實(shí)驗(yàn)：選用7-8周齡，雌性NOD鼠，24只隨機(jī)分為3組，每組8只，分別為： (1)對(duì)照組(C:無碘添加水)；(2)高碘組(HI：飲0.05％NaI水)；(3)高

3、碘聯(lián)合poly(I:C)組(I+P：飲0.05％NaI水并腹腔注射poly(I:C)(按5.0μg/g體重標(biāo)準(zhǔn)，分別于實(shí)驗(yàn)第一周和最后一周每日、隔日一次))。作用9周后取材：觀測(cè)體重、甲狀腺重量及解剖形態(tài)；采用RIA法檢測(cè)血清中甲狀腺激素及甲狀腺特異抗體水平；HE染色觀察甲狀腺組織形態(tài)學(xué)變化；TUNEL終端標(biāo)記法分析甲狀腺中細(xì)胞凋亡情況；SYBR GREEN實(shí)時(shí)熒光定量PCR法分析基因NIS、TSH-R、TRAIL、TRAIL-sR1、

4、CCL21、CXCL10、ICAM-1的mRNA表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參。 離體實(shí)驗(yàn)：取7-8周齡NOD小鼠甲狀腺，采用Ⅰ型膠原酶-中性蛋白酶(dispase)雙酶法聯(lián)合消化分離得到甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞。用含10％胎牛血清(FCS)Coon's F-12培養(yǎng)基接種細(xì)胞，24h后細(xì)胞貼壁后FCS降至3％，另外添加甲狀腺刺激激素(TSH)、氫化可的松、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素和L-谷氨酰胺。利用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法、RT-PCR法和電化學(xué)發(fā)光免

5、疫分析法鑒定培養(yǎng)小鼠甲狀腺細(xì)胞特性。對(duì)成功培養(yǎng)的小鼠甲狀腺細(xì)胞隨機(jī)分組并施加處理因素：對(duì)照組(C：空白)、高碘組(HI：10<'-3>M KI)、poly(I:C)組(P：25.0μ/m polyI:C)、高碘聯(lián)合poly(I：C)組(I+P：10<'-3>M KI+25.0μg/ml polyI:C)。處理因素作用24h后，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，RT-PCR法合成cDNA，SYBR GREEN實(shí)時(shí)熒光定量分析基因NIS、TSH-

6、R、TRAIL、TRAIL-sR1、CCL21、CXCL10、ICAM-1的mRNA表達(dá)，以GAPDH作為內(nèi)參基因。 結(jié)果： 在體實(shí)驗(yàn)：與C組相比，HI組和I+P組兩實(shí)驗(yàn)組小鼠體重?zé)o顯著性變化，介于25.0-27.0g之間，而甲狀腺絕對(duì)重量及相對(duì)重量均明顯增加(P<0.01)；血清總T4水平均顯著下降(P<0.05)；各組均未檢測(cè)到血清抗-TgAb、抗-TPO Ab抗體。HE染色結(jié)果顯示：C組NOD鼠無甲狀腺炎癥發(fā)生；H

7、I組全部發(fā)生甲狀腺炎，其中甲狀腺濾泡受累程度Ⅱ級(jí)(12.5％)、Ⅲ級(jí)(50.0％)、Ⅳ級(jí)(37.5％)；I+P組除全部發(fā)生甲狀腺炎外，甲狀腺濾泡受累程度Ⅳ級(jí)所占比例升至50.0％。TUNEL終端標(biāo)記結(jié)果表明，HI組和I+P組凋亡細(xì)胞數(shù)量較C組明顯增加，凋亡指數(shù)(AI)升高(P<0.01)。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，碘過量可抑制NIS表達(dá)，而上調(diào)TSH-R、TRAIL、TRAIL-sR1、CCL21、CXCL10、ICAM-1的表

8、達(dá)；碘過量聯(lián)合poly(I：C)可進(jìn)一步加重對(duì)NIS表達(dá)的抑制，但逆轉(zhuǎn)對(duì)TSH-R mRNA表達(dá)的上調(diào)作用，同時(shí)促進(jìn)TRAIL、TRAIL-sR1、CCL21、CXCL10、ICAM-1表達(dá)的上調(diào)。 離體實(shí)驗(yàn)：小鼠甲狀腺細(xì)胞在體外呈貼壁式生長(zhǎng)并具有上皮樣細(xì)胞特點(diǎn)；Tg染色胞漿呈陽(yáng)性著色；并具有特異TPO、Tg、NIS、TSH-R mRNA表達(dá)和分泌T3、T4的功能，但其表達(dá)與分泌量有隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈遞減趨勢(shì)。定量RT-PCR結(jié)

9、果與在體結(jié)果基本一致：碘過量可抑制NIS表達(dá)，而上調(diào)TSH-R、TRAIL、TRAIL-sR1、CCL21、CXCL10、ICAM.1的表達(dá)；碘過量聯(lián)合poly(I：C)可進(jìn)一步加重對(duì)NIS表達(dá)的抑制，但逆轉(zhuǎn)對(duì)TSH-R mRNA表達(dá)的上調(diào)作用；同時(shí)促進(jìn)對(duì)TRAIL、TRAIL-sR1、CCL21、CXCL10、ICAM-1表達(dá)的上調(diào)作用：只是在培養(yǎng)的NOD鼠甲狀腺細(xì)胞中未檢測(cè)到CCL21mRNA表達(dá)。另外，體外實(shí)驗(yàn)單獨(dú)觀察了poly(

10、I：C)對(duì)上述基因表達(dá)的影響，結(jié)果顯示poly(I：C)對(duì)甲狀腺特異基因NIS和TSH-R都具有直接抑制作用，而對(duì)其他凋亡相關(guān)和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)因子的mRNA表達(dá)，除對(duì)TRAIL-sR1具有輕微抑制，均呈現(xiàn)不同程度的上調(diào)作用。 結(jié)論： 1.高碘飲水9周可導(dǎo)致NOD小鼠發(fā)生自身免疫性甲狀腺炎，表現(xiàn)為血清總T4水平下降，甲狀腺中凋亡細(xì)胞大量產(chǎn)生，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，局部濾泡破壞，但未檢測(cè)到甲狀腺特異抗體存在。定量PCR結(jié)果顯示甲狀

11、腺中NIS mRNA表達(dá)下降，TSH-R、凋亡相關(guān)因子TRAIL、TRAIL-sR1以及免疫細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)因子CXCL21、CXCLl0、ICAM-1mRNA表達(dá)上調(diào)。 2．Poly(I:C)促進(jìn)高碘作用下血清總T4水平的下降，加重局部濾泡破壞；加劇甲狀腺NIS mRNA表達(dá)的下降，逆轉(zhuǎn)對(duì)TSH-R mRNA表達(dá)的上調(diào)作用，而協(xié)同對(duì)凋亡相關(guān)因子和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)因子mRNA表達(dá)的上調(diào)。 3．成功建立小鼠甲狀腺細(xì)胞原代培養(yǎng)模