力達(dá)霉素抗胰腺癌作用的分子機(jī)制研究.pdf

1、胰腺癌是一種預(yù)后極差的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其死亡率高，5年生存率低于5％，發(fā)病率呈逐年增加趨勢(shì)。由于胰腺癌發(fā)病隱襲，臨床表現(xiàn)多無(wú)特異性，病情進(jìn)展迅速，早期缺乏敏感和特異的診斷指標(biāo)，大多數(shù)患者在確診時(shí)己達(dá)晚期或有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，只有10％～15％的患者有手術(shù)切除的機(jī)會(huì)，其中能根治者僅5％～7．5％，因此藥物治療對(duì)于胰腺癌患者來(lái)說(shuō)是必不可少的治療手段。 力達(dá)霉素(Lidamycin，LDM)是從一株放線菌(Streptomycesglobi

2、sporus C-1027)代謝產(chǎn)物中獲得的對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有強(qiáng)烈殺傷作用的大分子肽類抗腫瘤抗生素。力達(dá)霉素分子由一個(gè)酸性的輔基蛋白和一個(gè)烯二炔發(fā)色團(tuán)組成，其中發(fā)色團(tuán)是力達(dá)霉素的主要活性部分，具有斷裂DNA的作用，而輔基蛋白的主要作用是保護(hù)發(fā)色團(tuán)。大量研究表明，力達(dá)霉素具有極強(qiáng)的抗腫瘤活性，目前正在進(jìn)行臨床Ⅱ期試驗(yàn)研究。本課題選用人胰腺癌PANC-1和SW1990細(xì)胞株，探討力達(dá)霉素對(duì)人胰腺癌細(xì)胞的影響及其作用機(jī)制，并通過(guò)人胰腺癌細(xì)胞SW

3、1990裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)，觀察力達(dá)霉素在體內(nèi)的抗胰腺癌作用。此外，還研究了力達(dá)霉素與健擇(Gemcitabine，吉西他濱)聯(lián)合作用對(duì)胰腺癌細(xì)胞的影響，并探討其作用機(jī)制，從而為力達(dá)霉素的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。 一、力達(dá)霉素作用于胰腺癌的體外實(shí)驗(yàn)研究。 1．MTT法檢測(cè)力達(dá)霉素(LDM)對(duì)人胰腺癌PANC-1和SW1990細(xì)胞的增殖抑制作用。不同濃度的阿霉素(ADM)、絲裂霉素(MMC)、紫杉醇(Taxol)、吉西他濱(Ge

4、mcitabine)和LDM作用細(xì)胞48 h后，利用MTT法檢測(cè)各種藥物對(duì)胰腺癌細(xì)胞的增殖抑制作用。MTT結(jié)果顯示，與臨床常用化療藥物相比，LDM抑制細(xì)胞的增殖作用更強(qiáng)，對(duì)PANC-1和SW1990細(xì)胞的。IC<,50>值分別為0.955±0.414 nM和0.426±0.212 nM，低于其他藥物的10<'3>～10<'4>倍。 2．Hoechst 33342熒光染色法和Annexin V-FITC/PI染色結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)

5、細(xì)胞凋亡。不同濃度LDM作用細(xì)胞48h后，細(xì)胞凋亡比率逐漸增高，呈濃度依賴性，其中0.1 nM LDM、1 nM LDM、2 nM LDM和10 nM LDM作用于PANC-1細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率分別為12.33％±0.66％、32.26％±1.58％、45.03％±3.16％和59.44％±4.04％，作用于SW1990細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率分別為22.21％±0.28％、22.83％±0.26％、42.52％±0.67％和50.35％±0.5

6、6％，顯著高于對(duì)照組的6.15％±1.47％和7.51％±0.45％(P<0.001)。熒光顯微鏡下可見1 nM、2 nM和10 nM LDM作用組的細(xì)胞出現(xiàn)染色質(zhì)凝集、細(xì)胞核固縮、核碎裂、形成凋亡小體等典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。 3.利用PI單染并結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)LDM對(duì)細(xì)胞周期的影響。檢測(cè)結(jié)果顯示，1 nM LDM主要將細(xì)胞阻滯在G2/M期，2 nM LDM能引起S期和G2/M期阻滯，10 nM LDM則主要誘導(dǎo)S期阻滯。

7、 4.利用 Transwell實(shí)驗(yàn)觀察LDM對(duì)胰腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LDM對(duì)PANC-1細(xì)胞和SW1990細(xì)胞的遷移和侵襲能力均有顯著的抑制作用，并且LDM的作用濃度越大，抑制作用越強(qiáng)，呈現(xiàn)明顯的濃度依賴關(guān)系。 5.Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示LDM能夠減少基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)蛋白在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平，并且隨著LDM作用濃度的增加，抑制蛋白表達(dá)的作用亦隨之加強(qiáng)，提示LDM

8、通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)MMP-9的含量而有效抑制細(xì)胞的遷移和侵襲能力，并呈劑量依賴性。 6.Western blot和RT-PCR結(jié)果表明，LDM能夠明顯抑制胰腺癌細(xì)胞中VEGF蛋白的表達(dá)，但不影響細(xì)胞中VEGF tuRNA的表達(dá)水平，說(shuō)明LDM是在轉(zhuǎn)錄后的翻譯水平對(duì)VEGF的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)。 7.細(xì)胞中K-ras蛋白和tuRNA表達(dá)水平，以及p-AKT和NF-кB蛋白含量都隨LDM作用濃度的增高而降低，呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。LD

9、M對(duì)于細(xì)胞中的AKT蛋白含量沒(méi)有影響，表明LDM能夠抑制AKT蛋白的磷酸化過(guò)程。 二、力達(dá)霉素作用于胰腺癌的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究。 1.利用人胰腺癌SW1990移植瘤裸鼠模型檢測(cè)LDM的體內(nèi)抗腫瘤作用。在瘤塊接種后的第7天開始給藥，每周1次，共2次。LDM通過(guò)尾靜脈注射，給藥劑量為0.02 mg/kg和0.04 mg/kg；Gemcitabine通過(guò)腹腔注射，給藥劑量為80mg/kg；對(duì)照組給予生理鹽水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LDM

10、和Gemcitabine對(duì)SW1990細(xì)胞移植瘤的生長(zhǎng)均有抑制作用，并且LDM顯示出更強(qiáng)的抑瘤效果。實(shí)驗(yàn)第31天處死動(dòng)物，剝?nèi)「鹘M動(dòng)物的瘤塊進(jìn)行比較，計(jì)算抑瘤率，其中Gemcitabine組的抑瘤率為38.87％，LDM 0.02 mg/kg劑量組和0.04 mg/kg劑量組的抑瘤率分別為65.71％和78.27％，與對(duì)照組相比具有顯著性差異。 2.腫瘤組織切片經(jīng)HE染色，顯微鏡下可見，LDM作用組的腫瘤組織出現(xiàn)血管減少，腫瘤細(xì)

11、胞壞死增多等病理學(xué)變化。 3.利用脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記(TUNEL)技術(shù)，對(duì)裸鼠腫瘤組織中的凋亡細(xì)胞進(jìn)行觀察和比較。TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組和GelncitabiIle組相比，LDM治療組中凋亡細(xì)胞明顯增多。 4.免疫組化結(jié)果顯示，LDM能夠抑制腫瘤細(xì)胞中K-ras蛋白和CD31蛋白的表達(dá)，并呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系，表明LDM具有抑制腫瘤新生血管生成的作用。 三、力達(dá)霉素與吉西他濱聯(lián)合作用于

12、胰腺癌的體外實(shí)驗(yàn)研究。目前，健擇(Gemcitabine，吉西他濱)是臨床上用于治療胰腺癌的一線藥物，健擇與其他化療藥物合用治療腫瘤亦得到廣泛研究和應(yīng)用，本課題對(duì)力達(dá)霉素聯(lián)合健擇對(duì)胰腺癌細(xì)胞的作用進(jìn)行了研究，并探討其主要作用機(jī)理。 1.MTT結(jié)果顯示，1 nM LDM與500 nM Gemcitabine聯(lián)合作用時(shí)，能夠明顯抑制細(xì)胞增殖，其CDI<0.75，具有協(xié)同抗腫瘤作用。 2.TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與單獨(dú)用藥相比

13、較，1 nM LDM聯(lián)合500 nMGemcitabine作用于PANC-1和SW1990細(xì)胞，能夠明顯提高凋亡細(xì)胞的比率。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，二者聯(lián)合用藥作用PANC-1和SW1990細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率分別為59.44％±1.54％和54.68％±2.62％，顯著高于Gemcitabine單獨(dú)作用組的18.48％±0.94％和25.79％±2.06％(P<0.05)。 3.RT-PCR結(jié)果顯示，500 nM Gemcitab

14、ine和1 nM LDM聯(lián)合作用能夠顯著降低PANC-1和SWl990細(xì)胞中K-ras mRNA的表達(dá)水平。 4.Wrestern blot結(jié)果表明，LDM與Gemcitabine聯(lián)合作用于PANC-1和SW1990細(xì)胞，能夠減少細(xì)胞中K-ras蛋白的表達(dá)；500 nM Gemcitabine或1 nM LDM單獨(dú)作用時(shí)，使細(xì)胞中的NF-кB蛋白水平提高，但二者聯(lián)用能夠顯著降低細(xì)胞中NF-кB的蛋白表達(dá)水平。 5．利用熒

15、光探針JC-1負(fù)載，通過(guò)共聚焦激光掃描顯微鏡觀察和測(cè)定細(xì)胞線粒體膜電位的改變，結(jié)果表明，LDM與Gemcitabine聯(lián)合作用能夠明顯降低細(xì)胞的線粒體膜電位。 6．Caspase-3活性測(cè)定結(jié)果表明，LDM和Gemcitabine聯(lián)合作用，能夠?qū)е翽ANC-1和SW1990細(xì)胞內(nèi)的凋亡系統(tǒng)caspase-3蛋白酶激活；Western blot結(jié)果顯示，LDM與Gemcitabine聯(lián)合作用，能夠顯著降低PANC-1和SW1990