采用組織工程技術(shù)建造生物性人工軟骨.pdf

1、采用組織工程技術(shù)建造生物性人工軟骨摘要在面中部或鼻基部區(qū)域，由于創(chuàng)傷、腫瘤或先天性畸形等原因，導(dǎo)致的局部軟骨缺損需要進(jìn)行軟骨重建，以達(dá)到美觀和功能效果，而現(xiàn)有的治療方法不能滿足臨床軟骨缺損治療的需要，因此在現(xiàn)代頭頸外科領(lǐng)域，迫切需要新的治療方法對(duì)大塊軟骨缺損進(jìn)行修復(fù)。而且由于至今沒有任何一種修復(fù)材料能夠完全達(dá)到或基本滿足人體對(duì)氣管移植物的條件要求，因此對(duì)喉和氣管缺損后如何進(jìn)行修復(fù)重建，仍是醫(yī)學(xué)研究面臨的難題之一。 由于自體肋軟骨

2、和耳軟骨具有能夠保持移植活力、吸收少等優(yōu)點(diǎn)，因此在臨床上獲得廣泛應(yīng)用，但存在供體材料來源有限、需二次手術(shù)等缺點(diǎn)，而且自體肋軟骨移植有遠(yuǎn)期鈣化傾向，從而限制了其臨床應(yīng)用。同種異體及異種軟骨移植物存在自溶現(xiàn)象、引起免疫排斥反應(yīng)以及傳播病原等限制，因而難以廣泛應(yīng)用。由于軟骨自身修復(fù)能力有限，而現(xiàn)有治療方法又不能完全滿足臨床需要，因此迫切需要科研人員嘗試新的技術(shù)和手段，對(duì)軟骨缺損進(jìn)行治療。 組織工程學(xué)是一門跨學(xué)科的新領(lǐng)域，它應(yīng)用工程學(xué)和

3、生命科學(xué)的基本原理試圖建造能夠用于重建、維持或提高缺損組織功能的生物性人體組織。組織工程研究為臨床上修復(fù)因各種原因?qū)е碌能浌侨睋p帶來了希望。近年來，科研人員應(yīng)用國外研制的可生物降解聚合物作為支架，成功地在動(dòng)物體內(nèi)培育出組織工程化人工軟骨，如耳形軟骨、鼻樣軟骨等，應(yīng)用國內(nèi)研制的支架材料成功進(jìn)行軟骨再造的研究較少。本研究應(yīng)用國產(chǎn)支架材料，對(duì)采用組織工程技術(shù)建造生物性人工軟骨進(jìn)行了研究，實(shí)驗(yàn)主要包括以下三個(gè)部分：1.聚(乙交酯-丙交1酯)泡沫

4、材料的研制、物理性能檢測(cè)以及生物學(xué)評(píng)價(jià)。2.軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)、鑒定、生物學(xué)特性及軟骨細(xì)胞—聚合物復(fù)合體體外培育的實(shí)驗(yàn)研究。3.采用組織工程技術(shù)建造生物性人工軟骨的實(shí)驗(yàn)研究。研究結(jié)果簡(jiǎn)述如下： 在第一部分，本研究采用溶媒投放、顆粒瀝濾技術(shù)制備了PLGA泡沫材料，并對(duì)PLGA泡沫材料的物理性能進(jìn)行了測(cè)試。測(cè)試結(jié)果表明，應(yīng)用層壓技術(shù)研制可生物降解并具有一定解剖形狀及三維立體構(gòu)型的細(xì)胞支架材料，孔徑為180-350μm，孔隙率為85％

5、，基本上滿足了組織工程細(xì)胞支架材料的要求，具有潛在應(yīng)用前景。本研究還對(duì)采用層壓技術(shù)加工的三維多孔支架材料，通過細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)以及肌內(nèi)植入實(shí)驗(yàn)，對(duì)PLGA支架材料生物相容性進(jìn)行了檢測(cè)和評(píng)價(jià)，結(jié)果表明PLGA支架材料具有良好的生物相容性，從而為PLGA材料進(jìn)一步作為軟骨細(xì)胞支架材料提供必要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和安全性依據(jù)。 在第二部分，首先獲取兔四肢，無菌條件下銳性分離關(guān)節(jié)表面的軟骨組織，然后參照Klagsbrun方法，應(yīng)用Ⅱ型膠原酶(2mg/

6、ml)消化軟骨片斷，經(jīng)消化后所獲細(xì)胞在含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞長(zhǎng)滿后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。通過細(xì)胞形態(tài)以及軟骨細(xì)胞特異性染色等手段，證實(shí)所培養(yǎng)的細(xì)胞為軟骨細(xì)胞。原代培養(yǎng)的兔軟骨細(xì)胞可以進(jìn)行傳代，細(xì)胞生長(zhǎng)過程的穩(wěn)定期相對(duì)較長(zhǎng)，約在第3代至第8代之間，細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn)較為穩(wěn)定，因此酶消化法是原代軟骨細(xì)胞培養(yǎng)較為理想的方法。在本研究中，在檢測(cè)細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞活力后，將軟骨細(xì)胞懸液離心并濃縮成2X107細(xì)胞/ml。隨后將軟骨細(xì)胞接種

7、到支架材料上，形成的細(xì)胞-支架復(fù)合體或者在旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器內(nèi)(RCCS)培育，或者在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)。不同時(shí)間取材后，進(jìn)行大體和組織學(xué)分析，結(jié)果顯示在RCCS系統(tǒng)中培育的復(fù)合體有明顯軟骨形成，而后者在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)僅有少量軟骨形成。上述結(jié)果表明RCCS系統(tǒng)2能夠?yàn)榧?xì)胞生長(zhǎng)提供最大限度模擬體內(nèi)生長(zhǎng)的環(huán)境。 在第三部分，本研究應(yīng)用層壓法將PLGA加工成具有顱骨樣、鼻軟骨樣形狀的片狀和具有軟骨環(huán)樣形狀的圓筒狀。從兔關(guān)節(jié)軟骨分離、培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，濃縮

8、后，密度為2x107個(gè)細(xì)胞/ml。將軟骨細(xì)胞接種到PLGA支架上形成復(fù)合體，靜止放置4小時(shí)，以使細(xì)胞貼壁，隨后進(jìn)行旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器或培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培育，一周后分別將復(fù)合體植入到裸鼠背部皮下。術(shù)后定期取材，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行大體和組織學(xué)分析。結(jié)果表明，經(jīng)RCCS培育過的細(xì)胞-支架復(fù)合體在術(shù)后4周、8周，在外觀上形成了與聚合物支架形狀基本一致的軟骨組織，即呈現(xiàn)顱骨樣及鼻軟骨樣形狀新生軟骨，圓筒狀支架材料則形成了帶有氣管環(huán)樣形狀的氣管軟骨。在應(yīng)用各種檢測(cè)手段