香煙提取物對(duì)人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞MMP-9、TIMP-1分泌的影響及意義.pdf

1、目的:研究表明，香煙煙霧中的有害毒性物質(zhì)多達(dá)上千種，是多種肺部疾病的共同危險(xiǎn)因素。也有研究提出，吸煙可能與特發(fā)性肺纖維化(IPF)的發(fā)病有著密切的關(guān)聯(lián)，但其具體作用機(jī)制尚不完全清楚。香煙煙霧中含有多種炎癥介質(zhì)，包括氧化劑(coxidant)和朊酶類(proteases)等，最終可導(dǎo)致蛋白酶/抗蛋白酶失衡參與眾多肺部疾病的發(fā)病。近年，在肺間質(zhì)纖維化的形成機(jī)制中，MMPs/TIMPs（金屬蛋白酶/金屬蛋白酶組織抑制劑）比例失衡逐漸成為研究的

2、熱點(diǎn)和重點(diǎn)。其中，MMP-9（基質(zhì)金屬蛋白酶-9）作為一種重要的基質(zhì)金屬蛋白酶，在細(xì)胞外基質(zhì)降解、肺組織結(jié)構(gòu)重塑等多種生理病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，參與多種肺部疾病的發(fā)生，其活性受特異性抑制劑，即基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1(TIMP-1)的調(diào)節(jié)。在各種外界刺激因素的作用下，二者比例及相互作用發(fā)生紊亂，可導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)降解受阻、細(xì)胞外蛋白沉積、肺組織重構(gòu)等病理改變，從而參與肺間質(zhì)纖維化(pulmonary interstitial fiber

3、osis)的發(fā)病。
　　本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)研究香煙提取物(cigerette smoking extract，CSE)對(duì)體外培養(yǎng)的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞來(lái)源的人A549細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix Metalloproteinase-9，MMP-9)及其組織抑制因子(tissue inhibitorofmetal loproteinase-1，TIMP-1)的影響，探討吸煙作為一種危險(xiǎn)因素參與肺間質(zhì)纖維化過(guò)程的可能機(jī)制。
　

4、　方法:體外培養(yǎng)人A549細(xì)胞，取指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。兩支去過(guò)濾嘴香煙由經(jīng)改造的50ml注射器負(fù)壓吸引裝置連續(xù)勻速抽吸燃燒著，將煙霧經(jīng)另一出口入20ml1640培養(yǎng)基中制成懸液。15分鐘內(nèi)將2支香煙燃盡。充分搖動(dòng)使其溶解，用氫氧化鈉(NAOH)將pH調(diào)至7.4左右，0.22um孔徑的濾器過(guò)濾，除去細(xì)菌和雜質(zhì)，所得溶液在30分鐘內(nèi)用于實(shí)驗(yàn)。將原液配成不同濃度干預(yù)人A549細(xì)胞24小時(shí)，并依據(jù)濃度的不同將實(shí)驗(yàn)分為四組:對(duì)照組、A組（2.

5、5％CSE干預(yù)組）、B（5％CSE干預(yù)組）、C(10％CSE干預(yù)組)。并分別收集C組干預(yù)A549細(xì)胞0h，3h，6h，9h，12h，48h的培養(yǎng)上清液。光學(xué)倒置電子顯微鏡分別觀察四組細(xì)胞干預(yù)24小時(shí)后的形態(tài)學(xué)變化;酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)法檢測(cè)上清液中MMP-9、TIMP-1的濃度;分別收集干預(yù)24h后各組培養(yǎng)細(xì)胞，提取細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，BCA法測(cè)定蛋白濃度，Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞中MMP-9、TIMP-1蛋白的表達(dá)。<

6、br>　　結(jié)果:
　　1、細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化
　　倒置顯微鏡觀察各組培養(yǎng)24小時(shí)后的細(xì)胞形態(tài)。對(duì)照組細(xì)胞表現(xiàn)為貼壁、扁平梭形生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛。在經(jīng)過(guò)不同CSE濃度干預(yù)后的A（2.5％CSE干預(yù)組）、B（5％CSE干預(yù)組）、C(10％CSE干預(yù)組)三組細(xì)胞形態(tài)較對(duì)照組差異較大，且呈現(xiàn)出干預(yù)濃度越高，細(xì)胞生長(zhǎng)情況越差的特點(diǎn)。主要表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)量減少、體積縮小，細(xì)胞貼壁能力下降，細(xì)胞之間空間增大。而C組細(xì)胞形態(tài)變化較對(duì)照

7、組更為顯著。大部分細(xì)胞已回縮變圓且細(xì)胞密度明顯減低，胞內(nèi)顆粒狀物質(zhì)明顯增多，細(xì)胞貼壁能力大大減低。
　　2、CSE干預(yù)后A549細(xì)胞分泌MMP-9的變化
　　ELISA結(jié)果顯示，對(duì)照組MMP-9含量為（1.70±0.12ng/ml），A、B、C三組濃度呈現(xiàn)逐漸升高趨勢(shì)，三組與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05），且A、B、C三組之間相互比較差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。同時(shí)，觀察C組作用不同時(shí)間MMP-9的表

8、達(dá)我們可以發(fā)現(xiàn)，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其表達(dá)呈不斷升高趨勢(shì)。0h時(shí)其濃度為（1.76±0.31 ng/ml），48h時(shí)其濃度最高達(dá)到(9.29±0.76 ng/ml)。經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析可以得出結(jié)論，3h-48h各組與0h比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，9h-48h與3h比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3、CSE干預(yù)后A549細(xì)胞分泌TIMP-1的變化
　　ELISA結(jié)果顯示，對(duì)照組TIMP-1含量為(2.

9、20±0.31 ng/ml)，A、B、C三組濃度呈現(xiàn)逐漸升高趨勢(shì)，三組與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且A、B、C三組之間相互比較也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。同時(shí)，觀察C組作用不同時(shí)間TIMP-1的表達(dá)我們可以發(fā)現(xiàn)，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其表達(dá)呈不斷升高趨勢(shì)。0h時(shí)其濃度為（2.52±0.41 ng/ml），48h時(shí)其濃度最高達(dá)到（16.31±0.96ng/ml）。經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析可以得出結(jié)論，3h-48h各組與0h比

10、較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，9h-48h與3h比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。
　　4、CSE干預(yù)后A549細(xì)胞MMP-9/TIMP-1的變化
　　ELISA結(jié)果顯示在A549細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后，對(duì)照組MMP-9/TIMP-1數(shù)值為(0.77±0.05)，而在經(jīng)CSE干預(yù)后的A、B、C三組數(shù)值相比對(duì)照組均降低，三組與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05），但各組間兩兩比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.

11、05）。觀察C組在干預(yù)的不同時(shí)間MMP-9/TIMP-1比值的變化發(fā)現(xiàn)，12h、24h及48h與0h比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而3h、6h及9h與0h比較無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。0h、6h與3h比較差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而9h、12h、24h、48h與3h比較差異則具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。
　　5、 CSE干預(yù)A549細(xì)胞24h后MMP-9、TIMP-1蛋白的表達(dá)
　　各組細(xì)胞干預(yù)24小時(shí)后Western Blo

12、t顯示，對(duì)照組MMP-9及TIMP-1蛋白表達(dá)較少，而A、B、C各組兩種蛋白表達(dá)均較對(duì)照組升高，且隨著干預(yù)濃度的升高蛋白表達(dá)逐漸增加。
　　結(jié)論:
　　1、CSE能引起肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞分泌MMP-9、TIMP-1增加。
　　2、CSE能引起肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞分泌MMP-9、TIMP-1增加，且呈現(xiàn)出時(shí)間及濃度依賴性。
　　3、CSE能引起MMP-9/TIMP-1比例失衡，并呈現(xiàn)出先高后低的趨勢(shì)。
　　4、CS