遠(yuǎn)端胃癌和賁門癌中雜合性丟失的差異研究.pdf

1、目的：腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多階段的過(guò)程，是各種遺傳改變累積的結(jié)果，涉及癌基因的激活和腫瘤抑制基因(tumorsuppressorgene，TSG)的失活。根據(jù)Knudson的TSG失活形式的理論，檢測(cè)腫瘤細(xì)胞染色體上特定DNA多態(tài)標(biāo)記，分析雜合性丟失(lossofheterozygosity，LOH)已成為目前檢測(cè)TSG失活和發(fā)現(xiàn)及定位新的TSG的重要手段之一。胃癌是一種異質(zhì)性的腫瘤，遠(yuǎn)端胃癌(adenocarcinomaofdistals

2、tomach，ADS)和賁門癌(adenocarcinomaofgastriccardia，AGC)分別具有其獨(dú)特的生物學(xué)和流行病學(xué)特征，提示這兩種腫瘤發(fā)生的遺傳學(xué)機(jī)制可能是不同的，因此探討ADS和AGC相關(guān)基因是闡明其發(fā)生分子機(jī)制，進(jìn)行特異性的診斷和治療的前提。 最近的比較基因組雜交(comparativegenomehybridization，CGH)及LOH研究顯示ADS和AGC中染色體4q和8p21-p23缺失頻率較高，

3、提示染色體4q和8p21-p23上可能存在與ADS和AGC發(fā)生相關(guān)的TSG。要證實(shí)或發(fā)現(xiàn)染色體4q和8p21-p23區(qū)域內(nèi)的與ADS和AGC發(fā)生相關(guān)的TSG，還需進(jìn)一步精細(xì)限定這兩種腫瘤患者在這兩個(gè)染色體區(qū)域內(nèi)的LOH頻率及范圍。在本文研究中，我們首先采用激光捕獲顯微切割(lasercapturemicrodissection，LCM)技術(shù)對(duì)腫瘤患者手術(shù)組織標(biāo)本中正常的胃粘膜細(xì)胞及相應(yīng)的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行特異性的捕獲，去除組織異質(zhì)性因素后利用

4、多重置換擴(kuò)增技術(shù)(multipledisplacementamplification，MDA)對(duì)LCM捕獲細(xì)胞DNA進(jìn)行高質(zhì)量的全基因組擴(kuò)增(wholegenomeamplification，WGA)，進(jìn)而利用擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行LOH分析。我們的前期研究結(jié)果顯示W(wǎng)GA產(chǎn)物用于LOH分析的結(jié)果是可靠的。本文中，我們選擇了15個(gè)定位于染色體4q上的微衛(wèi)星多態(tài)標(biāo)記，13個(gè)定位于8p21-p23區(qū)域的微衛(wèi)星多態(tài)性標(biāo)記，采用聚合酶鏈反應(yīng)(polymer

5、asechainreaction，PCR)結(jié)合硝酸銀染色的方法分析了30例ADS和16例AGC手術(shù)切除標(biāo)本的LOH情況，以期確定與ADS和AGC發(fā)生有關(guān)的TSG的缺失區(qū)域，比較二者的LOH差異。 材料與方法1.激光捕獲顯微切割特異性捕獲細(xì)胞46例新鮮胃癌切除標(biāo)本，其中ADS30例、AGC16例立即分別切取非癌胃粘膜和原發(fā)癌灶，OCT包埋，液氮中保存。8μm厚連續(xù)冷凍切片，按NIH推薦程序行HE染色。采用LM200型LCM系統(tǒng)，分

6、別獲取正常胃粘膜細(xì)胞、原發(fā)灶癌細(xì)胞各約5000個(gè)。 2.LCM捕獲細(xì)胞的基因組DNA提取將載有細(xì)胞的塑料帽置于預(yù)先加有30μlDNA裂解緩沖液的0.5ml離心管，37℃水浴16h。 3.全基因組多重置換擴(kuò)增根據(jù)Genomiphi說(shuō)明書(shū)進(jìn)行MDA擴(kuò)增。每份樣品重復(fù)兩次MDA擴(kuò)增，將兩次擴(kuò)增產(chǎn)物混勻，并稀釋20倍用于LOH分析。 4.微衛(wèi)星標(biāo)記的選擇從UCSC人類基因組注釋數(shù)據(jù)庫(kù)和Marshfield數(shù)據(jù)庫(kù)選取28個(gè)

7、覆蓋染色體4q(n=15)和8p21-p23(n=13)的微衛(wèi)星標(biāo)記。 5.LOH分析在10μlPCR反應(yīng)體系中加入0.5μl稀釋20倍的全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物，1μl10×ExTaq緩沖液，0.8μl2.5mmol/LdNTPs，0.05μlExTaq聚合酶、0.8μl10μmol/L的引物混合物。94℃變性1min后，94℃30s，55℃75s，72℃15s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸6min。取2μlPCR產(chǎn)物與8μl甲酰胺變性

8、示蹤液稀釋混合，98℃變性8min，冰上冷卻5min。加樣5μl于8％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(含7M尿素)，500v電泳，室溫2.5h。電泳結(jié)束，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的硝酸銀染色方法進(jìn)行染色。觀察等位片段大小及信號(hào)強(qiáng)度。所有出現(xiàn)LOH的結(jié)果，重復(fù)PCR及電泳進(jìn)行驗(yàn)證。 6.LOH的判定相對(duì)于配對(duì)的正常組織，腫瘤組織DNA的一條等位基因條帶密度減少70％以上時(shí)可判為L(zhǎng)OH。 7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析分析ADS和AGC之間各個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的LOH差

9、異及LOH與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。所用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法為雙側(cè)Fisher檢驗(yàn)，P＜0.05被認(rèn)為統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著意義，所用的統(tǒng)計(jì)軟件為SPSS11.0. 結(jié)論：1.我們應(yīng)用PCR為基礎(chǔ)的LOH分析方法對(duì)激光捕獲顯微切割的30例ADS和16例AGC手術(shù)切除標(biāo)本及其配對(duì)的正常組織中染色體4q和8p21-p23區(qū)的LOH作了較詳細(xì)的研究。 2.我們篩選出一個(gè)與ADS發(fā)生特異相關(guān)的染色體4q的共同丟失區(qū)域即4q32.2-35.1，兩個(gè)

10、與AGC發(fā)生特異相關(guān)的染色體4q的共同丟失區(qū)域4q13.3-4q24和4q31.21-4q35.1。這些區(qū)域內(nèi)可能存在分別與ADS和AGC發(fā)生有關(guān)的多個(gè)TSG，可以指導(dǎo)進(jìn)一步進(jìn)行這些位點(diǎn)附近的高密度微衛(wèi)星標(biāo)記的LOH分析，確定這些位點(diǎn)附近的最小缺失片段，縮小遺傳學(xué)距離，為尋找新的TSG奠定基礎(chǔ)。 3.我們篩選出兩個(gè)與ADS發(fā)生特異相關(guān)的染色體8p21-p23區(qū)域內(nèi)的共同缺失區(qū)域即D8S1099-8p23ATGG和D8S1130-

11、D8S1106，物理距離分別為2.2Mb和1Mb，一個(gè)與AGC發(fā)生相關(guān)的共同缺失區(qū)域?yàn)?p22GGAA-8p22ATCT(1.2Mb)。縮小了染色體8p21-p23區(qū)域LOH的物理距離，為進(jìn)一步的定位和克隆與ADS和AGC發(fā)生相關(guān)的TSG提供了重要資料。而且這三個(gè)區(qū)域彼此不重疊，表明ADS和AGC的發(fā)生過(guò)程中可能有不同的染色體改變。 4.D4S3254位點(diǎn)的缺失顯示出與AGC發(fā)生相關(guān)的趨勢(shì)，此區(qū)域內(nèi)的TSG可能與AGC和ADS的