血小板依賴(lài)Shp2和P2X1-P38的新激活機(jī)制研究.pdf

1、第一部分蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2在血小板膠原和ADP信號(hào)中的作用及機(jī)制
　　Shp2是含有兩個(gè)SH2功能域的蛋白酪氨酸磷酸酶，在多種生長(zhǎng)因子，激素及細(xì)胞因子等應(yīng)答中都發(fā)揮了重要的生物學(xué)作用。以往的研究認(rèn)為，Shp2通過(guò)與血小板表面PECAM-1受體胞內(nèi)段磷酸化的ITIM結(jié)合，參與抑制GPVI信號(hào)通路，然而其具體的作用機(jī)制一直以來(lái)仍不明確。本研究進(jìn)一步探索了Shp2對(duì)血小板功能的影響及可能的作用機(jī)制。結(jié)果概括為以下四點(diǎn):(1)Shp

2、2的抑制劑PHPS1顯著抑制低濃度膠原和ADP引起的血小板聚集及釋放。在相當(dāng)于人體動(dòng)脈流速的剪切應(yīng)力(1000 s-1)作用下，抑制Shp2可明顯抑制血小板在膠原表面的黏附。PHPS1可抑制血小板在固定的纖維蛋白原上的鋪展，卻不影響凝血酶引起的血塊收縮，說(shuō)明Shp2參與了血小板早期的由外向內(nèi)的信號(hào)通路(outside-in signaling)，而不參與晚期的由外向內(nèi)信號(hào)通路。(2)免疫共沉淀顯示，低濃度膠原引起的血小板激活過(guò)程中Shp

3、2與Syk結(jié)合形成蛋白復(fù)合物，PHPS1能夠抑制二者結(jié)合，且該過(guò)程不依賴(lài)整合素αⅡb3。高濃度膠原刺激下，Shp2-Syk復(fù)合物不能被PHPS1所解離。(3)免疫印跡結(jié)果顯示，PHPS1能夠抑制低濃度膠原或ADP引起的血小板Akt和Erk的磷酸化水平，而不影響高濃度膠原介導(dǎo)的Akt/Erk磷酸化水平。(4)低濃度膠原或ADP刺激下，Syk抑制劑BAY61-3606能夠抑制血小板聚集，及下游Akt/Erk磷酸化水平。本研究驗(yàn)證了血小板在低

4、濃度膠原刺激下Shp2與Syk結(jié)合，二者共同調(diào)控下游Akt/Erk磷酸化水平，并引起血小板活化。PHPS1抑制二者結(jié)合，進(jìn)而影響下游Akt/Erk磷酸化水平，抑制血小板活化。在ADP信號(hào)通路中，Shp2主要參與ADP的P2Y12受體介導(dǎo)的信號(hào)，調(diào)控下游Akt/Erk磷酸化水平。
　　第二部分離子通道P2X1通過(guò)p38促進(jìn)血栓烷A2引起的血小板聚集和釋放
　　P2X1是血小板表面表達(dá)的唯一ATP受體。雖有研究認(rèn)為P2X1通過(guò)活

5、化Erk促進(jìn)低濃度膠原引起的血小板活化，但P2X1的其他功能仍不明確。我們的研究發(fā)現(xiàn)ATP通過(guò)P2X1受體形成血小板激活的正反饋，ATP激活p38從而增強(qiáng)低濃度血栓烷A2類(lèi)似物(U46619)引起的血小板聚集和釋放。P2X1的抑制劑NF449或脫敏P2X1受體均能抑制低濃度U46619引起的血小板聚集及P－選擇素表達(dá)。P2X1的刺激劑αβ-Me-ATP能夠引起p38的磷酸化，且呈現(xiàn)劑量時(shí)間依賴(lài)性。 P38的抑制劑SB203580而不是M

6、ek的抑制劑U0126能夠引起與NF449類(lèi)似的抑制效果，但同時(shí)使用NF449和SB203580則沒(méi)有疊加效果，提示ATP可能通過(guò)引起p38的活化進(jìn)而促進(jìn)U46619引起的血小板激活。我們將P2X1受體脫敏或抑制后發(fā)現(xiàn)，U46619引起的p38磷酸化在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均明顯下降，Erk磷酸化并不受影響。而U46619激活的血小板中，p38抑制劑SB203580并不影響Erk磷酸化， Mek抑制劑U0126也不影響p38磷酸，進(jìn)一步驗(yàn)證了Erk