蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2調(diào)控肺部炎癥和細(xì)菌清除的機制研究.pdf

1、研究背景和研究目的:
　　慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD)是一種以持續(xù)氣流受限為特征的可以預(yù)防和治療的常見呼吸系統(tǒng)疾病，其氣流受限多呈進行性發(fā)展，引起COPD急性加重的主要原因是下呼吸道反復(fù)感染，其中流感嗜血桿菌是COPD急性加重的主要病原菌之一。不可分型流感嗜血桿菌是多形的G-桿菌，是上呼吸道常見的定植菌。NTHi侵入下呼吸道后會損害氣道黏膜纖毛清除能力，造

2、成氣道粘液分泌增加和上皮受損。這些病理改變可以加速細(xì)菌在呼吸道的定植和感染，造成肺實質(zhì)損傷和進行性小氣道阻塞，從而促進COPD的發(fā)生發(fā)展。
　　巨噬細(xì)胞在病原微生物與衰老細(xì)胞的清除、促進炎癥反應(yīng)、誘發(fā)適應(yīng)性免疫反應(yīng)及損傷組織的重構(gòu)與修復(fù)過程中起著關(guān)鍵作用。巨噬細(xì)胞在不同微環(huán)境的作用下可分為兩種類型:M1和M2型。M1型巨噬細(xì)胞分泌大量的炎癥因子，并能夠高效遞呈抗原，激活Thl細(xì)胞反應(yīng)，具有抗病原微生物和腫瘤細(xì)胞的作用。M2型巨噬細(xì)

3、胞殺菌能力比較弱，具有抑制Thl細(xì)胞免疫反應(yīng)，促進損傷組織修復(fù)、重構(gòu)和血管生長的功能。然而COPD患者中肺泡巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌以及分泌細(xì)胞因子的功能都受到嚴(yán)重紊亂，清除細(xì)菌能力受損。因此闡明NTHi感染后肺部炎癥反應(yīng)和細(xì)菌清除的細(xì)胞和分子機制，將為NTHi感染相關(guān)疾病預(yù)防和控制、臨床治療策略等提供新的思路，也可為新型藥物研制提供分子靶標(biāo)。
　　蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2(Src homology phosphotyrosyl phos

4、phatase2)是蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatase，PTP)家族成員之一，由PTPN11基因編碼并在人類細(xì)胞和組織中廣泛表達，參與調(diào)控多種胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號通路。而且SHP2與呼吸系統(tǒng)疾病關(guān)系密切，參與調(diào)控多種呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展。然而，目前SHP2基因?qū)Ψ尾考?xì)菌感染后急性炎癥的影響及其相關(guān)分子調(diào)控機制仍未得到深入的闡明。因此，我們將通過建立骨髓來源巨噬細(xì)胞和髓系細(xì)胞SHP2基因定向敲除小鼠NTH

5、i感染模型，探索SHP2基因及其相關(guān)信號通路在巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)和細(xì)菌清除中的作用。我們的研究有助于闡明SHP2在調(diào)控巨噬細(xì)胞分化以及增強機體抗菌免疫的分子機制，為肺部細(xì)菌感染的免疫學(xué)治療提供新的策略。
　　研究方法：
　　體內(nèi)試驗
　　1.建立急性肺NTHi感染模型:C57/BL6小鼠通過氣道滴注NTHi(1×107CFU/40μL)的方法建立肺部感染模型，分別于NTHi感染6h，12h，24h收集肺組織檢測IL-6，

6、TNF-α等炎癥因子的表達，同時檢測SHP2的表達情況。C57/BL6小鼠在NTHi感染前30分鐘腹腔注射SHP2特異性抑制劑PHPS1（3mg/kg），感染結(jié)束后肺組織做病理學(xué)檢查鏡下觀察PHPS1處理后小鼠炎癥反應(yīng)的變化，同時收集小鼠肺組織抽提RNA檢測炎癥介質(zhì)的表達，收集肺泡灌洗液檢測炎癥因子水平，明確PHPS1對NTHi所致肺部炎癥反應(yīng)的影響。
　　2.構(gòu)建髓系細(xì)胞SHP2基因敲除鼠動物感染模型:使用Cre-loxP技術(shù)實

7、現(xiàn)髓系細(xì)胞SHP2基因定向敲除，SHP2flox/flox小鼠與LysMcre+小鼠交配后可以得到髓系細(xì)胞定向敲除SHP2小鼠SHP2Δ/Δ（基因表型LysMcre+/SHP2flox/flox），同時得到的LysMcre+和SHP2flox/flox小鼠作為同窩對照小鼠，氣道滴注NTHi(1×107 CFU/40μL)后，肺組織病理切片觀察肺組織炎性反應(yīng)。收集肺組織檢測細(xì)菌負(fù)荷及炎性介質(zhì)的變化。
　　體外實驗
　　1.提取

8、C57/BL6小鼠的骨髓來源的巨噬細(xì)胞(BMDM):小鼠骨髓細(xì)胞體外經(jīng)C-MSF誘導(dǎo)分化為BMDM細(xì)胞，NTHi感染后檢測細(xì)胞SHP2的表達情況。PHPS1預(yù)處理BMDM后，加入NTHi刺激，檢測巨噬細(xì)胞表型變化，巨噬細(xì)胞吞噬作用及其殺菌作用。觀察PHPS1對巨噬細(xì)胞功能的影響。分離LysMcre+/SHP2flox/flox來源的BMDM，檢測NTHi感染后巨噬細(xì)胞表型變化，明確SHP2在巨噬細(xì)胞分化中的作用。
　　2.NTHi

9、刺激髓系細(xì)胞敲除SHP2鼠來源的BMDM后，檢測STAT1，STAT6，AKT, p65磷酸化水平，闡明SHP2參與巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的信號通路。
　　結(jié)果：
　　1.NTHi感染C57/BL6小鼠12h后，SHP2基因表達的升高，TNF-α，IL-6，MIP-2等炎癥介質(zhì)表達水平顯著增高，肺部病理切片顯示肺泡結(jié)構(gòu)遭到破壞，肺泡間隔微血管充血水腫，并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤。
　　2.抑制SHP2可以有效減弱NTHi誘導(dǎo)的肺

10、部炎癥反應(yīng)。小鼠腹腔注射PHPS1可以抑制肺組織產(chǎn)生IL-6，TNF-a炎癥因子，減少肺組織炎癥細(xì)胞浸潤。
　　3.C57BL/6小鼠BMDM感染NTHi后，SHP2基因水平和蛋白水平表達均有顯著升高。PHPS1抑制SHP2后，可以抑制NTHi感染后M1型巨噬細(xì)胞的分化，同時促進NTHi感染后M2型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物YM-1，ARG的表達。并且PHPS1削弱了巨噬細(xì)胞的殺菌能力。
　　4.SHP2敲除鼠SHP2Δ/Δ感染NT

11、Hi后，肺組織炎性細(xì)胞浸潤減少，肺組織和肺泡灌洗液中細(xì)菌負(fù)荷升高，SHP2Δ/Δ來源的巨噬細(xì)胞感染NTHi后，巨噬細(xì)胞M1標(biāo)記物表達降低，而細(xì)胞M2標(biāo)記物YM-1表達增高。
　　5.敲除BMDM中的SHP2基因，顯著下調(diào)NTHi誘導(dǎo)的p-65 NF-κB磷酸化。提示SHP2可能通過調(diào)節(jié)p-65磷酸化活性，來調(diào)節(jié)NF-κB信號通路，從而抑制了細(xì)菌誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。
　　結(jié)論：
　　研究發(fā)現(xiàn)SHP2參與調(diào)控了NTHi