心血管活性物質(zhì)salusin-β的心肌保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：Salusin-β是一種新發(fā)現(xiàn)的心血管調(diào)節(jié)肽，其心血管效應(yīng)遠(yuǎn)未闡明。本研究的目的是探明salusin-β是否具有抗心肌缺血再灌損傷作用及其機(jī)制。 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃头椒?1.離體心臟缺血再灌損傷模型 離體大鼠心臟懸掛于Langendorff系統(tǒng)后以95％O2+5％CO2飽和的KH液進(jìn)行逆行恒壓(80cmH2O)灌流。將前端帶有球囊的導(dǎo)管經(jīng)左心房插入左心室，通過調(diào)節(jié)球囊的體積將左室舒張末壓調(diào)至6mmHg。經(jīng)過2

2、5min的平衡灌流后，全心停灌45min后復(fù)灌30min。salusin-β預(yù)處理組于停灌前5min給予10-10mol/L、10-9mol/L、10-8mol/Lsalusin-β。 2.心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型 以fluo-3/AM負(fù)載的大鼠心室肌細(xì)胞用100％O2飽和的臺(tái)氏液液灌流15min后，用1mmol/LNa2S2O4引起化學(xué)缺氧的無糖臺(tái)氏液灌流15min作為缺氧，然后轉(zhuǎn)換成氧合(100％O2)臺(tái)氏液灌流10mi

3、n，作為復(fù)氧過程。10-8mol/Lsalusin-β在缺氧復(fù)氧前5min開始灌流。 3.無鈉外液灌流引起的鈣超載模型 用酶解法分離大鼠心室肌細(xì)胞，以fluo-3/AM為鈣指示劑，對(duì)照組心肌細(xì)胞臺(tái)氏液灌流15min后換以無鈉臺(tái)氏液灌流10min，10-8mol/Lsalusin-β在無鈉臺(tái)氏液灌流前5min開始灌流。 4.心肌細(xì)胞全細(xì)胞電流記錄 將酶解法分離得到的細(xì)胞懸液加入細(xì)胞池內(nèi)，并以1ml/min的

4、速度用細(xì)胞外液灌流。玻璃微電極由自動(dòng)拉制儀(P-97)制備，用電極內(nèi)液充灌，電極電阻通常為2-4MO，形成高阻封接前補(bǔ)償液結(jié)電位，補(bǔ)償快電容后再用較大負(fù)壓吸破細(xì)胞膜，補(bǔ)償電容電流和電極串聯(lián)電阻，形成全細(xì)胞記錄模式。串聯(lián)電阻補(bǔ)償70-90％。在電流鉗模式下記錄動(dòng)作電位，在電壓鉗模式下記錄各種電流。所有實(shí)驗(yàn)均在室溫(20-23℃)進(jìn)行，信號(hào)經(jīng)Ag/AgCl電極引導(dǎo)，由膜片鉗放大器(EPC10，德國)放大，計(jì)算機(jī)通過軟件(Pulse/Puls

5、efit)經(jīng)模/數(shù)轉(zhuǎn)換系統(tǒng)采集數(shù)據(jù)，用Igor程序進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 二、主要結(jié)果 (一)Salusin-β對(duì)離體大鼠心臟缺血再灌后心功能的影響 在缺血停灌前期間，各阻心率、冠脈流量以及各項(xiàng)心功能觀察指標(biāo)基本保持恒定，各組間各指標(biāo)無顯著差別。心率、冠脈流量復(fù)灌時(shí)顯著低于停灌前，后逐步恢復(fù)，各組心率無顯著差別。 (二)Salusin-β對(duì)缺氧復(fù)氧和無鈉外液灌流引起的心肌細(xì)胞鈣超載的影響 1.對(duì)照組心肌細(xì)

6、胞胞內(nèi)鈣離子濃度(以相對(duì)值表示，缺氧前為1)缺氧后10min內(nèi)逐步上升，10min時(shí)為1.36±0.14，缺氧后期胞內(nèi)鈣離子濃度迅速上升，15min時(shí)為1.69±0.17，復(fù)氧后胞內(nèi)鈣離子濃度進(jìn)一步上升，復(fù)氧后2min為1.79±0.22，復(fù)氧后期胞內(nèi)鈣離子濃度保持相對(duì)穩(wěn)定。 10-8mol/Lsalusin-β組心肌細(xì)胞在缺氧復(fù)氧期間胞內(nèi)鈣離子濃度上升的速度要慢于對(duì)照組，缺氧10min、15min胞內(nèi)鈣離子濃度分別為1.10±

7、0.18(p＜0.01vscontrol)和1.34±0.28(p＜0.01vscontrol)，復(fù)氧2min時(shí)為1.51±0.25(p＜0.01vscontrol)，均顯著低于對(duì)照組。以上結(jié)果表明salusin-β可以減輕缺氧復(fù)氧引起的心肌細(xì)胞鈣超載。 2.對(duì)照組和salusin-β組心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度在臺(tái)氏液灌流期間無明顯差別，而用無鈉臺(tái)氏液灌流后，對(duì)照組心肌細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子濃度迅速上升，10min時(shí)為1.49±0.13，而

8、10-8mol/Lsalusin-β組心肌細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子濃度無鈉外液灌流10min時(shí)為1.26±0.06，顯著低于對(duì)照組(p＜0.01)。以上結(jié)果表明salusin-β可以減輕無鈉外液灌流引起的心肌細(xì)胞鈣超載。 (三)Salusin-β對(duì)心肌細(xì)胞對(duì)動(dòng)作電位(AP)、L型鈣通道電流(ICa,L)、鈉鈣交換電流(INaCa)、鈉電流(INa)、ATP敏感鉀通道電流(IKATP)、瞬時(shí)外向鉀電流(Ito)、持久激活鉀電流(Isus)、

9、內(nèi)向整流鉀電流(IK1)等電流的影響 1.在全細(xì)胞電流鉗模式下記錄大鼠心室肌細(xì)胞AP，10-10-10-7mol/Lsalusin-β對(duì)靜息電位、動(dòng)作電位幅度無明顯影響。10-8mol/L和10-7mol/Lsalusin-β可以明顯縮短APD50和APD90。對(duì)照APD50為43.70±6.23ms，給予10-8mol/L和10-7mol/Lsalusin-β后分別為34.55±2.88ms(p＜0.05vscontrol)和

10、29.65±3.40ms(p＜0.01vscontrol)。對(duì)照APD90為82.29±14.55ms，給予10-8mol/L和10-7mol/Lsalusin-β后分別為60.92±4.68ms(p＜0.05vscontrol)和51.25±8.20ms(p＜0.01vscontrol)。沖洗后部分逆轉(zhuǎn)salusin-β縮短APD的作用。 2.在斜坡刺激中以對(duì)Ni2+敏感部分的電流作為INaCa。Salusin-β對(duì)內(nèi)向、外向

11、INaCa均有抑制作用，10-8mol/Lsalusin-β使心室肌內(nèi)向INaCa(-100mV)從-3.94±0.66pA/pF降為-2.47±0.41pA/pF(p＜0.05)，使外向INaCa(+50mV)從2.93±0.42pA/pF降為2.02±0.35pA/pF(p＜0.05)。 3、Salusin-β呈濃度依賴性抑制大鼠心肌細(xì)胞ICa,L，10-10-10-7mol/Lsalusin-β灌流5min后ICa，L分別

12、下降6±4％、10±6％、22±6％、30±9％，后兩者顯著高于對(duì)照組的5±3％(p＜0.01，n=8)。10-8mol/Lsalusin-β灌流5min后Ⅳ曲線明顯上移，但不改變ICa，L的電壓依賴關(guān)系和反轉(zhuǎn)電位。對(duì)照ICa,L激活曲線的半激活電位是-18.23±1.41mV，斜率是4.70±0.18mV，10-8mol/Lsalusin-β灌流后半激活電位是-18.84±1.55mV，斜率是4.83±0.21mV。對(duì)照ICa,L失活

13、曲線半失活電位是-26.44±1.28mV，斜率是4.12±0.15mV。10-8mol/Lsalusin-β灌流后半失活電位是-26.99±1.36mV，斜率是4.05±0.17mV。上述結(jié)果表明salusin-β不改變L型鈣通道激活和失活的門控特點(diǎn)。 4.在由50mV到-100mV持續(xù)125ms的斜坡刺激下記錄心肌細(xì)胞KATP通道電流。10-8mol/Lsalusin-β不能使該電流增加，給予pinacidil后該電流明顯增

14、加，并且能被glibenclamide阻斷(說明該電流是IKATP)。10-8mol/Lsalusin-β也不能抑制IKATP，在0mV時(shí)pinacidil使IKATP增加為6.41±1.90pA/pF，再給予salusin-βIKTP為6.24±1.86pA/pF，兩者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(p＞0.05，n=8)，提示salusin-β即不能使靜息狀態(tài)下的KATP通道開放，也不能使已經(jīng)開放的KTP通道關(guān)閉。 5.Salusin-β使I

15、toⅠ-Ⅴ曲線上移，10-8mol/Lsalusin-β灌流后5min后去極化全30mV、40mV、50mV、60mV時(shí)的Ito電流密度值分別為7.84±1.10pA/pF、9.41±1.22pA/pF、11.30±1.49pA/pF和13.11±1.74pA/pF，均顯著高于對(duì)照組的6.51±0.89pA/pF、7.82±0.98pA/pF、9.40±1.04pA/pF和10.87±1.26pA/pF(p＞0.05，n=6)，沖洗后基

16、本恢復(fù)。Isus在給予salusin-β后未發(fā)生明顯改變。 6.Salusin-β對(duì)IMa峰值、到達(dá)峰值時(shí)間、Ⅳ曲線、反轉(zhuǎn)電位無明顯影響。 7.心肌細(xì)胞超級(jí)化至-120mV時(shí)的IK1為21.95±4.17pA/pF，10-8mol/Lsalusin-β灌流后10minIK1為21.93±4.10pA/pF，兩者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P＞0.05，n=6)。Salusin-β不改變IK1的Ⅰ-Ⅴ曲線形態(tài)，也沒有使其向左右移動(dòng)或上下

17、移動(dòng) 三、結(jié)論 本工作在離體灌流大鼠心臟缺血再灌損傷模型中，觀察到salusin-β能夠顯著改善復(fù)灌后心功能指標(biāo)；在缺氧復(fù)氧和無鈉外液灌流引起的心肌細(xì)胞鈣超載模型中，觀察到salusin-β可以顯著減輕心肌細(xì)胞鈣超載；在研究salusin-β對(duì)心肌細(xì)胞動(dòng)作電位、通道電流的影響中，觀察到salusin-β能夠顯著縮短動(dòng)作電位時(shí)程，抑制鈉鈣交換電流和L型鈣通道電流，增加順時(shí)外向鉀電流，而對(duì)ATP敏感鉀通道電流、內(nèi)向整流鉀電流