負(fù)性共刺激分子BTLA-HVEM在慢性乙肝患者外周血T細(xì)胞上的表達(dá)特性及其臨床意義.pdf

1、乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)是一種不直接引起細(xì)胞破壞的嗜肝性DNA病毒,是導(dǎo)致慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B, CHB)、乙肝肝硬化、甚至是導(dǎo)致肝癌的主要原因之一。由HBV持續(xù)感染引起的CHB是世界性傳染病,嚴(yán)重威脅著人類健康。機(jī)體中HBV特異性T細(xì)胞通過與HBV抗原多肽結(jié)合后對感染的肝細(xì)胞進(jìn)行識別并予以殺滅,被認(rèn)為是導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷及病毒清除的主要機(jī)制。體內(nèi)存在一定數(shù)量、活躍的、多特

2、異性的CD4+和CD8+T細(xì)胞與HBV病毒的清除密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)慢性HBV感染的患者,其體內(nèi)HBV特異性CD4+和CD8+T細(xì)胞數(shù)量及應(yīng)答功能出現(xiàn)不足導(dǎo)致病毒清除無效,這種現(xiàn)象叫做 T細(xì)胞耗竭,它是病毒持續(xù)感染和肝臟炎癥的主要因素。T細(xì)胞功能的正常發(fā)揮需要雙信號的刺激,其接受的第一信號由抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell,APC)表達(dá)的MHC-抗原肽復(fù)合物和T細(xì)胞表面的T細(xì)胞受體(T cell recepto

3、r,TCR)相互結(jié)合產(chǎn)生,而第二信號由共刺激分子的相互作用提供。而近年來發(fā)現(xiàn),共刺激分子中除了有參與傳遞正性信號的正性共刺激分子,還有負(fù)性共刺激分子,對免疫細(xì)胞的適當(dāng)活化與增殖發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)耗竭T細(xì)胞表面異常性高表達(dá)負(fù)性共刺激分子,目前研究較多有:PD-1、CTLA-4和Tim-3分子等。B、T淋巴細(xì)胞衰減子(B and T lymphocyte attenuator,BTLA)是2003年新發(fā)現(xiàn)的負(fù)性共刺激分子,其屬于 CD2

4、8/B7超家族成員。配體為TNFR/TNF家族的成員單純皰疹病毒侵入介質(zhì)HVEM(herpesvirus entry mediator)。BTLA和配體 HVEM結(jié)合后,胞漿區(qū)的三個(gè)酪氨酸殘基都可以磷酸化, ITIM(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif)招募酪氨酸磷酸酶 SHP-1和SHP-2,并進(jìn)一步介導(dǎo)傳遞抑制T細(xì)胞活化、增殖的負(fù)性信號。部分研究也初步揭示了BTLA/HVEM

5、信號通路在T細(xì)胞耗竭中可能起到了重要的作用。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)檢測了慢性乙肝患者外周血中 T細(xì)胞上 BTLA和HVEM共刺激分子的表達(dá)特性,并分析了它們的表達(dá)水平與慢性乙肝相關(guān)的臨床指標(biāo)之間的相關(guān)性。探討了BTLA/HVEM對HBV慢性感染的影響,從而初步揭示了負(fù)性共刺激分子在T細(xì)胞上的表達(dá)特性及其意義,為臨床診斷提供有價(jià)值的指標(biāo)。本研究分為兩個(gè)部分：
　　第一部分：負(fù)性共刺激分子BTLA及其配體HVEM在慢性乙肝患者外周血T細(xì)

6、胞上表達(dá)的檢測與分析。
　　目的：采用免疫熒光標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)檢測 CHB患者外周血 CD4+T和CD8+T細(xì)胞表面表達(dá)的BTLA和HVEM分子的表達(dá)水平,探討B(tài)TLA/HVEM共刺激信號在CHB發(fā)病機(jī)制中可能的作用,進(jìn)一步為有效治療CHB提供理論依據(jù)。
　　方法：采用免疫熒光標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)檢測了44例慢性乙肝患者和40例健康志愿者外周血CD4+T和CD8+T淋巴細(xì)胞表面BTLA和HVEM的表達(dá)。通過GraphPad Pr

7、ism5.0軟件分析、比較了健康組和慢性乙肝組之間BTLA和HVEM共刺激分子在CD4+T和CD8+T淋巴細(xì)胞上的表達(dá)水平變化情況。
　　結(jié)果：結(jié)果顯示,與健康組相比,BTLA和HVEM在慢性乙肝組CD4+T細(xì)胞上表達(dá)明顯出現(xiàn)了上調(diào);而與健康組相比,慢性乙肝組中的CD8+BTLA+和CD8+HVEM+T細(xì)胞的比例則呈更為顯著性上調(diào)。并且,CD4+T和CD8+T淋巴細(xì)胞表面BTLA和HVEM分子的表達(dá)之間都表現(xiàn)出正相關(guān)性。
　

8、　結(jié)論：慢性乙肝患者外周血T細(xì)胞上BTLA和HVEM分子都異常高表達(dá),并且兩者之間具有正的相關(guān)性,可能參與構(gòu)成了T細(xì)胞耗竭的因素之一。
　　第二部分：BTLA/HVEM在慢性乙肝患者外周血T細(xì)胞上的表達(dá)與臨床指標(biāo)相關(guān)性的分析。
　　目的：通過分析CD4+T和CD8+T細(xì)胞上BTLA和HVEM分子的表達(dá)水平與慢性乙肝相關(guān)臨床指標(biāo)之間的相關(guān)性,從而探討B(tài)TLA/HVEM負(fù)性分子在慢性乙肝的進(jìn)展的可能臨床意義,為慢性乙肝患者臨床檢

9、測和干預(yù)提供有潛在價(jià)值的指標(biāo)。
　　方法：乙型肝炎血清學(xué)標(biāo)志,即乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎表面抗體(HBsAb)、乙型肝炎 e抗原(HBeAg)、乙型肝炎 e抗體(HBeAb)及乙型肝炎核心抗體(HBcAb)的檢測采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA);采用熒光定量PCR法檢測HBV DNA,檢測結(jié)果以>5×102 copies/ml判斷為陽性;肝功

10、能的檢測采用羅氏全自動(dòng)生化分析儀。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及相關(guān)性分析采用GraphPad Prism5.0軟件。
　　結(jié)果：結(jié)果顯示,慢性乙肝患者外周血CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞上BTLA的表達(dá)水平與與ALT和AST的水平均呈顯著正相關(guān),而與HBV-DNA載量沒有顯著相關(guān)性。
　　結(jié)論：HBV-DNA載量對T細(xì)胞上BTLA/HVEM的表達(dá)水平?jīng)]有影響,肝損傷指標(biāo)ALT、AST的水平與CD4+T和CD8+T細(xì)胞上BTLA/HVEM的表達(dá)

11、水平呈現(xiàn)出正相關(guān)。肝損傷指標(biāo) ALT、AST的水平能夠反映肝臟損傷的程度,其水平越高肝臟的損傷程度也越嚴(yán)重。T細(xì)胞殺傷感染了HBV病毒的肝細(xì)胞可能是造成肝損傷的主要原因,T細(xì)胞上高表達(dá)的BTLA/HVEM能夠?qū)е耇細(xì)胞免疫應(yīng)答下調(diào),從而達(dá)到保護(hù)肝臟免受過度的損傷,但同時(shí)這也導(dǎo)致HBV病毒在機(jī)體內(nèi)的長期存在形成了長期慢性感染。綜上所述,本研究初步證實(shí)了慢性乙肝患者外周血 CD4+T和 CD8+T細(xì)胞BTLA/HVEM表達(dá)的水平顯著升高,并