負(fù)性共刺激分子在慢性乙肝患者外周血Treg的表達(dá)特性及其臨床意義.pdf

1、由乙肝病毒（Hepatitis B virus, HBV）感染導(dǎo)致的慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B, CHB）為世界范圍內(nèi)的傳染性疾病，與肝硬化、肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。HBV感染誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生以細(xì)胞毒性T細(xì)胞（cytotoxict lymphocyte，CTL）特異性免疫應(yīng)答為主的多種抗病毒免疫反應(yīng)。當(dāng)病毒不能有效清除而持續(xù)復(fù)制，將會(huì)導(dǎo)致HBV感染慢性化，發(fā)展為慢性乙型肝炎，其主要原因可能是HBV特異性CTL的免疫

2、應(yīng)答減弱。CTL的免疫功能缺失與抑制性受體分子的上調(diào)表達(dá)、抑制性細(xì)胞因子的產(chǎn)生、抗原遞呈失調(diào)以及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（T regulatory, Treg）的負(fù)性調(diào)控有關(guān)。Treg主要亞群的表面標(biāo)志為CD4+CD25+，胞內(nèi)表達(dá)的Foxp3是其特異功能性分子。研究表明CD4+CD25+Foxp3+Treg可對(duì)多種免疫細(xì)胞發(fā)揮抑制效應(yīng)，通過(guò)抑制HBV特異性的CD4+和CD8+T細(xì)胞的活性，使病毒得不到徹底清除而持續(xù)感染，導(dǎo)致乙型肝炎的慢性化。Tr

3、eg的增殖及其免疫抑制功能與表面共刺激分子的表達(dá)有關(guān)。共刺激分子受體通過(guò)與其相應(yīng)配體相互作用，介導(dǎo)正性或負(fù)性共刺激信號(hào)，調(diào)節(jié)T細(xì)胞的增殖、細(xì)胞因子的產(chǎn)生、細(xì)胞毒性以及細(xì)胞的凋亡和存活等來(lái)控制T細(xì)胞的活化。BTLA與PD-1都是免疫球蛋白超家族的負(fù)性共刺激受體分子，分別與其配體HVEM和PD-L1相互作用產(chǎn)生負(fù)性共刺激信號(hào)，抑制T細(xì)胞的活化、增殖及其免疫學(xué)功能。研究表明PD-1介導(dǎo)的負(fù)性共刺激信號(hào)通路在慢性丙肝病毒（Hepatitis C

4、 virus, HCV）感染患者中，通過(guò)抑制Treg的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子的磷酸化，阻斷IL-2的作用，從而負(fù)性調(diào)控Treg的增殖，但PD-1在CHB患者Treg的表達(dá)特性及其對(duì)Treg的調(diào)控作用目前尚無(wú)報(bào)道。此外，BTLA和HVEM在Treg上的表達(dá)特性、對(duì)Treg的調(diào)控作用、BTLA/HVEM變化對(duì)Treg的影響及其在CHB中的意義目前也尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　本研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了CD4+CD25+FoxP3+Treg在慢性

5、乙肝患者中的比率及其表面負(fù)性共刺激分子PD-1、PD-L1、BTLA、HVEM的表達(dá)特性，并分析了Treg數(shù)量與慢性乙肝臨床指標(biāo)的相關(guān)性，以及分析了Treg表達(dá)的上述負(fù)性共刺激分子與臨床指標(biāo)的相關(guān)性，探討了PD-1、BTLA/HVEM對(duì)Treg的調(diào)節(jié)作用和PD-L1參與構(gòu)成Treg的抑制性功能，及其對(duì) HBV慢性感染的影響，從而初步揭示了負(fù)性共刺激分子在Treg的表達(dá)特性及其意義，為臨床診斷提供有價(jià)值的指標(biāo)。
　　一、慢性乙肝患者

6、CD4+CD25+FoxP3+Treg與其表面PD-L1的檢測(cè)及其與臨床指標(biāo)相關(guān)性的分析
　　【目的】通過(guò)檢測(cè)慢性乙肝患者外周血CD4+CD25+FoxP3+Treg占CD4+T細(xì)胞的比率，及其表面PD-L1的表達(dá)水平，并分析其與臨床指標(biāo)的相關(guān)性，探討Treg及PD-L1作為T(mén)reg抑制性功能分子對(duì)慢性乙肝的影響。
　　【方法】采用ELISA檢測(cè)乙型肝炎e抗原（HBeAg）等血清標(biāo)志；采用熒光定量PCR法檢測(cè)HBV DNA；

7、采用羅氏全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)肝功能的指標(biāo)；分離人外周血淋巴細(xì)胞，對(duì)CD4+CD25+Foxp3+Treg熒光標(biāo)記后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，并用GraphPad Prism5.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　【結(jié)果】慢性乙肝患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+T細(xì)胞的比例顯著高于健康人（P<0.05），并與慢性乙肝患者血清ALT及AST呈現(xiàn)正相關(guān)（P<0.05），但與HBV-DNA載量無(wú)較好的相關(guān)性；PD-L1在慢

8、性乙肝Treg中的表達(dá)較健康人顯著上調(diào)，且與Treg比率、肝損傷的血清標(biāo)志物ALT、AST均呈顯著的正相關(guān)，與HBV DNA沒(méi)有顯著相關(guān)性。
　　【結(jié)論】慢性乙肝患者外周血Treg數(shù)量的增加并與肝損傷指標(biāo)呈正相關(guān)性，這可能是由于其對(duì)HBV特異性CTL的免疫抑制作用的增強(qiáng)，從而使HBV持續(xù)感染并繼續(xù)惡化；PD-L1在CHB患者Treg上調(diào)表達(dá)并與Treg比率及肝損傷指標(biāo)呈正相關(guān)，其可能參與了Treg對(duì)HBV特異性CTL的免疫抑制功能

9、，有利于病毒的持續(xù)感染，促進(jìn)慢性乙肝的發(fā)生發(fā)展。
　　二、負(fù)性共刺激分子PD-1、BTLA和HVEM在慢性乙肝患者CD4+CD25+FoxP3+Treg的表達(dá)特性及其與臨床指標(biāo)相關(guān)性的分析
　　【目的】通過(guò)分析PD-1、BTLA和HVEM在CHB患者CD4+CD25+FoxP3+Treg的表達(dá)及其與Treg數(shù)量及臨床指標(biāo)的相關(guān)性，探討PD-1/PD-L1、BTLA/HVEM對(duì)Treg的負(fù)性調(diào)控作用及其變化對(duì)慢性乙肝的影響，為

10、臨床診斷和干預(yù)奠定理論基礎(chǔ)。
　　【方法】分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞，采用4色熒光標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+CD25+Foxp3+Treg表面PD-1、BTLA與HVEM的表達(dá)，利用Flowjo軟件分析流式測(cè)定結(jié)果，及采用GraphPad Prism5.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　【結(jié)果】PD-1在慢性乙肝Treg中的表達(dá)較健康人顯著下調(diào)且與Treg比率、肝損傷的血清標(biāo)志物ALT、AST均呈顯著的正相關(guān)，與HBV DNA沒(méi)

11、有顯著相關(guān)性；BTLA和HVEM在慢性乙肝Treg中的表達(dá)較健康人顯著下調(diào)，且BTLA與HVEM的表達(dá)水平呈正相關(guān)，與Treg比率、PD-1、PD-L1及肝損傷的血清標(biāo)志物ALT、AST均呈顯著的正相關(guān)，與HBV DNA沒(méi)有顯著相關(guān)性。
　　【結(jié)論】PD-1的慢性乙肝患者Treg的表達(dá)下調(diào)可能有助于乙肝患者體內(nèi)Treg的擴(kuò)增；BTLA和HVEM的表達(dá)也呈現(xiàn)同步下調(diào)，其與PD-1負(fù)性信號(hào)可能協(xié)同參與了對(duì)Treg的調(diào)控作用，該負(fù)性共刺

12、激分子與肝損傷指標(biāo)呈相關(guān)性的免疫學(xué)作用機(jī)理則尚待進(jìn)一步探討。
　　綜上所述，本研究初步闡明了CHB患者外周血Treg占CD4+T細(xì)胞的比率增加；Treg表達(dá)的負(fù)性共刺激分子PD-1、BTLA/HVEM相對(duì)于健康人呈下調(diào)，但隨著Treg數(shù)量的增加逐步上調(diào)，且與肝損傷指標(biāo)呈正相關(guān)性；PD-L1在CHB患者呈現(xiàn)上調(diào)，且與Treg比率、肝損傷指標(biāo)呈正相關(guān)性；從而表明負(fù)性共刺激分子PD-1、BTLA/HVEM可能參與了對(duì)Treg自身的調(diào)控，