負(fù)載SPIO聚合物納米囊泡用于人結(jié)腸癌細(xì)胞磁共振分子成像的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：(1)制備負(fù)載油性SPIO、水性SPIO聚合物納米囊泡；(2)驗(yàn)證負(fù)載油性SPIO、水性SPIO聚合物納米囊泡的理化特征；(3)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證負(fù)載油性SPIO、水性SPIO聚合物納米囊泡標(biāo)記人結(jié)腸癌細(xì)胞(LoVo)并進(jìn)行MRI成像的可能性；(4)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證負(fù)載油性SPIO、水性SPIO聚合物納米囊泡對(duì)結(jié)腸癌的MRI顯像能力。
　　 方法：⑴經(jīng)多步化學(xué)反應(yīng)得到的生物可降解共聚物PEG-PDLLA(聚乙二醇-聚(D,L-丙

2、交酯))，通過多次乳化及溶劑揮散法使共聚物在水溶液中自組裝成囊泡，在PEG-PDLLA聚合物囊泡中分別負(fù)載油性和水性SPIO；(2)掃描電鏡(Scanningelectron microscopy，TEM)和透視電鏡(Transmission electron microscopy，TEM)觀察負(fù)載油性、水性SPIO聚合物納米囊泡的直徑、形態(tài)、分布；(3)MR測(cè)量相同SPIO濃度的單純SPIO膠體液、負(fù)載油性、水性SPIO聚合物納米囊泡

3、的T2馳豫率(1/T2)；(4)體外培養(yǎng)人結(jié)腸癌細(xì)胞(LoVo)和人正常胎肝細(xì)胞(L-o2)，使細(xì)胞量達(dá)1×106/mL，同時(shí)加入不等量的負(fù)載油性、水性SPIO聚合物納米囊泡(25μg、50μg、100μg、200μg)，分別培養(yǎng)1h、3h、6h后，用MR測(cè)量T2馳豫率；比較負(fù)載SPIO聚合物納米囊泡對(duì)LoVo和人正常胎肝細(xì)胞(L-o2)的標(biāo)記能力；(5)MTT(Methyl thiazolyl tetrazolium)實(shí)驗(yàn)和胎盼藍(lán)染色

4、觀察負(fù)載SPIO聚合物囊泡的細(xì)胞毒性；(6)建立荷人結(jié)腸癌裸鼠移植瘤模型；(7)荷瘤動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：18只裸鼠分為三組，每組6只，分別從尾靜脈注射三種對(duì)比劑(單純SPIO膠體液、負(fù)載油性SPIO、水性SPIO聚合物納米囊泡)，注射劑量為2.5mg Fe/Kg，行動(dòng)態(tài)MRI掃描(0h、0.5h、1h、3h、6h、12h、24h、48h)觀察腫瘤、肝臟、肌肉的T2WI信號(hào)改變。⑺采用T2WI和T2 map掃描序列，用T2 mapping軟件測(cè)量T

5、2值。⑻細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用電鏡檢查和普魯士藍(lán)染色驗(yàn)證SPIO是否進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，用普魯士藍(lán)染色計(jì)算標(biāo)記率。
　　 結(jié)果：
　　 ①油性SPIO或水性SPIO分別負(fù)載于聚合物囊泡的中心膜及親水內(nèi)腔中，兩者的平均直徑分別為182.2nm、191.7nm。TEM顯示油性SPIO均勻地分散于囊泡的中心膜上；水性SPIO以“團(tuán)簇”的形式被包裹在囊泡的內(nèi)腔中。負(fù)載了SPIO的聚合物囊泡沒有改變自由SPIO的超順磁性特征。和單

6、純SPIO膠體液相比，負(fù)載SPIO聚合物囊泡表現(xiàn)出超高M(jìn)RI敏感性。在相同鐵離子濃度下，負(fù)載水性SPIO聚合物囊泡的T2馳豫率(1/T2)表現(xiàn)出高于負(fù)載油性SPIO聚合物納米囊泡的T2馳豫率。
　　 ②負(fù)載SPIO聚合物納米囊泡標(biāo)記細(xì)胞時(shí)，在106/mL水平的細(xì)胞量，即可被MRI檢出；負(fù)載油性SPIO聚合物囊泡在與LoVo細(xì)胞培養(yǎng)后6h，即可引起肉眼所見的信號(hào)下降；負(fù)載水性SPIO聚合物囊泡與細(xì)胞培養(yǎng)后3h，即可發(fā)現(xiàn)信號(hào)下降；而

7、且相同濃度的負(fù)載水性SPIO聚合物囊泡標(biāo)記細(xì)胞后比負(fù)載油性SPIO聚合物囊泡引起的T2馳豫率更高。負(fù)載SPIO聚合物納米囊泡標(biāo)記LoVo細(xì)胞比標(biāo)記L-o2細(xì)胞引起的T2馳豫率更高。普魯士藍(lán)染色顯示LoVo細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)藍(lán)色顆粒，標(biāo)記率在75％以上。電鏡切片觀察可見高密度鐵顆粒位于細(xì)胞漿內(nèi)。
　　 ③MTT試驗(yàn)：各種濃度的負(fù)載SPIO聚合物囊泡與L-o2細(xì)胞混合培養(yǎng)后，各OD(Optical density)值之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；胎盼

8、藍(lán)染色試驗(yàn)表明不同濃度SPIO聚合物囊泡標(biāo)記細(xì)胞后，細(xì)胞的活力在95％以上。
　　 ④動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：尾靜脈注射負(fù)載SPIO聚合物納米囊泡能引起腫瘤T2WI信號(hào)下降，注射后1～6h為明顯，最大值下降約11.4％，單純SPIO膠體液則未能引起腫瘤信號(hào)下降，三種對(duì)比劑引起的信號(hào)下降有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.01)，但負(fù)載油性和水性SPIO聚合物納米囊泡引起腫瘤T2WI信號(hào)下降則無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；注射負(fù)載SPIO聚合物納米囊泡兩組的腫瘤細(xì)胞普魯士藍(lán)

9、染色顯示細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)藍(lán)色顆粒，電鏡切片觀察可見高密度鐵顆粒位于細(xì)胞漿內(nèi)；而注射單純SPIO膠體液組電鏡和普魯士藍(lán)染色未有陽性發(fā)現(xiàn)。負(fù)載油性SPIO、水性SPIO聚合物納米囊泡、單純SPIO膠體液均引起肝臟T2WI信號(hào)下降，以注射后1～6h為明顯，三者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.01)，負(fù)載水性SPIO聚合物納米囊泡引起的信號(hào)下降最明顯，最大值下降約56％，其次為負(fù)載油性SPIO聚合物納米囊泡，最后為單純SPIO膠體液。三種對(duì)比劑均未引起肌肉組

10、織的T2WI信號(hào)下降。
　　 結(jié)論：
　　 ⑴負(fù)載SPIO聚合物納米囊泡比單純SPIO膠體液表現(xiàn)出更高的MRI敏感性，負(fù)載水性SPIO聚合物囊泡的T2馳豫率(1/T2)高于負(fù)載油性SPIO聚合物納米囊泡。
　　 ⑵在一定濃度范圍內(nèi)，負(fù)載SPIO聚合物納米囊泡無明顯的細(xì)胞毒性。
　　 ⑶負(fù)載SPIO聚合物納米囊泡標(biāo)記人結(jié)腸癌細(xì)胞是完全可能的，其中負(fù)載水性SPIO聚合物納米囊泡標(biāo)記細(xì)胞后引起的T2馳豫率更高。