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文檔簡介
1、本研究運用次抑菌濃度法在國際上首次成功地體外人工誘導出對頭孢曲松穩(wěn)定的高度耐藥的淋球菌菌株,運用抑制性削減雜交分析誘導耐藥前后淋球菌敏感株和耐藥株之間的耐藥相關基因并構建文庫,運用基因芯片結合雙色熒光技術驗證耐藥相關因并測序,基因序列輸入GenBank行同源性分析,最終確定介導首株耐頭孢曲松淋球菌人工誘導株對頭孢曲松耐藥的基因,闡明首株耐頭孢曲松淋球菌人工誘導株耐藥的分子機制。前瞻性地研究并闡明淋球菌耐頭孢曲松的分子機制,從而制定出防止
2、或延緩其耐藥性產生的措施,對我國乃至全球淋病的預防和治療將有十分重大的意義。 方法: 1.運用CRO次抑菌濃度法體外人工誘導對CRO敏感的淋球菌標準株ATCC49226、ATCC43069和臨床株ZSSY00205、ZSSY00206,誘導過程運用生化和分子生物學試驗監(jiān)測其菌種特性。 2. 運用隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD)分析淋球菌標準株ATCC49226和臨床株ZSSY00205誘導前后菌株的基因組DNA差
3、異。 3. 運用產色頭孢菌素法紙片試驗和藥物水解試驗檢測淋球菌標準株ATCC49226 和臨床株ZSSY00205誘導前后菌株產β-內酰胺酶情況。 4.運用紙片擴散法檢測淋球菌標準株ATCC49226和臨床株ZSSY00205誘導前后菌株對其他抗菌素的耐藥性變化。 5.運用抑制性削減雜交(SSH)構建淋球菌標準株ATCC49226和臨床株ZSSY00205誘導前后菌株的差異基因文庫,并隨機挑取50個克隆行基因測序
4、及功能初篩。 6.運用基因芯片(DNA MicroArray)和雙色熒光技術驗證淋球菌標準株ATCC49226和臨床株ZSSY00205誘導前后菌株的差異基因,標準組和臨床組差異基因文庫中分別隨機挑取192個克隆作為探針制作基因芯片,Cy3、Cy5標記誘導前敏感株和誘導后耐藥株DNA的RsaI酶切片斷,雜交、洗片后行雙色熒光掃描,挑取紅色熒光克隆20個行基因測序及功能分析。 結果: 1. 淋球菌標準株ATCC49
5、226、ATCC43069對于CRO的MIC值分別達到0.5μg/ml、0.25μg/ml,臨床株ZSSY00205、ZSSY00206對CRO的MIC值分別達到32.0μg/ml、16.01.μg/ml,誘導過程中淋球菌標準株ATCC49226、ATCC43069和臨床株ZSSY00205、ZSSY00206的生物學鑒定均表現為革蘭陰性雙球菌,氧化酶陽性,糖發(fā)酵見葡萄糖(+)、麥芽糖(-)、蔗糖(-)、乳糖(-),分子生物學鑒定均表現
6、為NspA基因陽性。 2. 誘導前后淋球菌標準株ATCC49226和臨床株ZSSY00205的隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD)圖譜無明顯差異。 3.誘導前后的淋球菌標準株ATCC49226和臨床株ZSSY00205的產色頭孢菌素法紙片試驗均為陰性,藥物水解試驗未見指向氨芐西林(AMP)、頭孢曲松(CRO)藥敏紙片的突出菌苔。 4.誘導后耐CRO的淋球菌標準株ATCC49226和臨床株.ZSSY00205較誘導前C
7、RO敏感株對青霉素、四環(huán)素、阿奇霉素、環(huán)丙沙星的抑菌環(huán)直徑均有降低。 5.成功地構建了淋球菌ATCC49226標準組和ZSSY00205臨床組的差異基因文庫,在ATCC49226標準組篩選出17個功能性差異基因,在ZSSY00205臨床組篩選出22個功能性差異基因。 6.基因芯片結合雙色熒光技術確定了包括mtrR、mtrC、gyrB、rpsJ、pJD1在內的多個耐藥基因,并發(fā)現2個不能與淋球菌基因組序列相匹配的新基因(分
8、別與腦膜炎萘瑟菌血清型A、霍亂弧菌l型生物變種有較大的同源性)。 結論: 1.CRO次抑菌濃度法可誘導CRO敏感的淋球菌標準株ATCC49226、ATCC43069和臨床株ZSSY00205、ZSSY00206成為穩(wěn)定的高度耐CRO菌株,雖歷經漫長的誘導過程,各菌株的種屬特性未發(fā)生改變。 2.誘導前后淋球菌標準株ATCC49226和臨床株ZSSY00205的基因組DNA未發(fā)生較大的改變。 3.誘導前后的淋
9、球菌標準株ATCC49226和臨床株ZSSY00205既不表達青霉素酶,也不表達ESBL或AmpC酶。 4.淋球菌標準株ATCC49226和臨床株ZSSY00205對CRO耐藥的同時均伴有對青霉素、四環(huán)素、阿奇霉素、環(huán)丙沙星等抗菌素耐藥性的增加,提示多重耐藥,可能與染色體介導的多基因突變有關。 5.綜合抑制性消減雜交(SSH)初篩結果和基因芯片(DNAMicroArray)驗證結果分析,淋球菌對CRO的耐藥機制主要與mt
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